聚焦7款热门miRNA表达谱芯片

近几年，microRNA（miRNA）的光芒已经盖过siRNA、mRNA，成为分子生物学中最闪耀的明星。细胞的发育、分化、增殖、凋亡，每个过程都有miRNA的调控，自然，它也与癌症发育息息相关。在许多人类肿瘤病例中，都发现miRNA表达异常，要么是成熟的miRNA，要么是前体miRNA，抑或二者皆有。miRNA也“戏路颇广”，既饰演正面人物-肿瘤抑制基因，有时也会扮演大反派-癌基因。

如此有潜质的生物标志物，研究人员自然不会视而不见。于是，miRNA表达谱分析成为miRNA研究中必不可少的一环。对于这种高通量的表达谱分析，芯片当然是首选。芯片采用大规模微阵列技术，一张芯片上包含成千上万个探针，大大提高了筛选的速度和通量。研究人员一般使用商业化的芯片，也有一些实验室使用定制的芯片。当然，还有一些公司还提供全套服务，比如LC Sciences（中国子公司为联川生物），它在2005年最早开发出miRNA分析服务。同年，Invitrogen和Exiqon也进入这个市场。对于这个变化极快的新领域而言，service是再合适不过了，因为可供参考的文献也不多，面对大量的数据，你可能一筹莫展。而服务公司经过多年的数据统计，发展了一套完善的数据分析系统，能够为客户快速锁定研究目标。

很多公司都推出了miRNA表达谱芯片，比如LC Sciences、Exiqon、Invitrogen、febit等等。各家公司的芯片有不少差异，比如芯片本身，探针、底物、样品量等。有些厂家能够在芯片上快速加入新发布的序列或客户要求的序列。还有的芯片能处理多个样品类型比如FFPE组织，这对临床应用很关键。当然，利用芯片来研究miRNA也有一些缺点，比如耗时较长，特异性问题和交叉杂交的风险，因为成熟的miRNA序列都很相似。

微流体芯片

miRNA研究领域发展之快，可用日新月异来形容。miRBase数据库也是一而再，再而三地升级，让各大公司奋力追赶。在2009年9月miRBase升级到14.0版的消息甫一发布，LC Sciences和febit就立马宣布其芯片升级。这是因为LC Sciences和febit都使用了微流体芯片，这让他们能够快速更新。

LC Sciences采用微流体μParaflo®芯片，再结合光敏酸化学技术和数字光控技术，保证了芯片体系的灵活性、高保真性（最长合成碱基可以到100nt）以及杂交体系的稳定性。微流体芯片是由数以千计的三维小室组成的闭合系统，隔绝了与空气接触的机会，不存在荧光染料的氧化和衰退问题；微流体技术还使得阵列上的样品溶液分布均一，同时促进了杂交反应，提高了洗脱过程的严谨性，因此LC Sciences的芯片可以实时监控扫描，针对每次非特异性杂交的洗脱过程进行实时监控，确保最后特异性杂交信号值的采集。同时，它引入了光敏酸（PGA）去保护法来进行探针分子常规单体的合成，而这一点在进行miRNA芯片合成时显现得尤为重要，由于成熟miRNA很短小，因此在进行探针原位合成时，需要进行碱基的修饰来提高杂交探针的检测灵敏度、特异性、均一化。

值得一提的是，LC Sciences芯片的探针经过特别合成，Tm值均一，提高杂交了的检测性和特异性。检测探针由目的序列的互补碱基和一个非核苷酸分子的伸展臂组成，伸展臂减少了空间位阻影响，提高了探针和目的片段的结合能力。

由于采用了微流体技术，LC Sciences的miRNA芯片除了实时更新外，还可以灵活定制，比如目前很多新发现的miRNA都可以加入它的芯片平台，进行表达谱分析实验。另据LC Sciences的商业发展总监介绍，该公司正在研发miRNA与mRNA 共表达芯片，预计在今年上半年上市，届时科研人员将可以在同一时期、同一反应、同一芯片平台上研究两者的表达关系。

德国Febit公司也是与时俱进的先进分子，它与吉奥生物联合推出了与Sanger miRBase 14.0同步的miRNA表达谱芯片。芯片采用独特的Geniom 微流体技术，即时酶标方法，以及全自动化的芯片处理，以极少量样本实现高灵敏度、高重现性的精确检测。芯片上有8个分开的微通道，每个含15,624阵点。此外，该芯片还采用了一种独特的微阵列方法，叫作微流引物延伸检测（Microfluidic Primer Extension Assay，MPEA），这种检测方法以Febit Geniom®微阵技术的使用为基础，miRNA在杂交前无需标记。接着，DNA聚合酶I的Klenow片段直接加入微量流动芯片的通道中，相应的miRNA得以特异延伸。此方法将杂交检测的特异性与酶延伸的高辨别能力相结合，相对于现有的其它微阵列方法，显示出不少优势。由于miRNA不需经过富集、PCR扩增或标记等预处理而直接导入，这样就确保避免了实验误差的产生。

著名的LNA技术

microRNA杂交的最大挑战是这些小RNA的大范围的退火温度。很难定义合适的杂交条件使得所有的miRNA都能特异而灵敏地检测。丹麦的Exiqon公司凭借其LNA（Locked Nucleic Acid，锁核酸）技术，深受研究人员的青睐。DNA探针和miRNA之间的键是不稳定的，因为DNA单体可在N构象和S构象之间来回移动。LNA是DNA类似物，其亚甲基桥用于锁定糖环，让单体保持在N位置。在高温下，LNA/RNA双链比DNA/RNA双链稳定。这增加了在微阵列筛选中的灵敏性和特异性，并减小了杂交误差。

Exiqon的miRCURT芯片的LNA探针与普通DNA捕获探针相比，可提升熔解温度，使得芯片上的所有探针Tm值均一化，所有miRNA杂交温度一致，保证对所有靶点具有相同的亲和活性。杂交温度高（60度）避免非特异结合，标记无序列偏向性，效率高，无需富集miRNA，因而在灵敏度方面，LNA芯片可以检测常规DNA探针无法检测到的极其微量的miRNA。这意味着Exiqon的芯片是目前市场上最灵敏的，90%的探针能够检测浓度在10 attomolar以下的miRNA，只需30 ng总RNA，就能进行图谱分析。

国内的康成生物是Exiqon miRNA芯片的独家代理商，不仅提供相关产品，而且技术人员还可以帮助完成实验操作和数据分析，只要提供给他们完好的组织或细胞样本，就可以拿到完整的实验报告。

一站式解决方案

Life Technologies的侧重点则是提供miRNA分析的完整流程，从总RNA的抽提，到芯片分析，及NCode Profiler软件的免费数据分析，再到定量RT-PCR试剂盒的数据验证。

众所周知TRIzol是分离总RNA的王牌之选，同样在miRNA的分离上，TRIzol也很有效。很多研究人员在实际分离miRNA时，都采用了TRIzol，而不是专门的miRNA抽提试剂盒。他们认为，如果细胞或组织的起始量没有限制，常规的TRIzol提取就已足够，质量和重复性都很好。如果样品有限或质量较差，则可以使用Ambion的mirVana miRNA分离试剂盒。

Invitrogen有两种预制的miRNA芯片，一种是针对人，另一种是多个物种的。NCode Human miRNA芯片V3印制在Corning环氧化物包被的玻片上，点有优化的探针序列，能靶定10.0版miRBase数据库中所有已知的人miRNA，以及373个假定的人miRNA。NCode™ Multi-Species miRNA芯片 V2则靶定了9.0版miRBase数据库中人、小鼠、大鼠、果蝇、线虫和斑马鱼的所有成熟miRNA。NCode芯片早在2005年推出，当时可谓是引领潮流，不过现在看来有些落后了，至少从内容上看是如此，有待更新哈。

不过，Life Technologies还有另一套秘密武器：TaqMan miRNA assay和TaqMan miRNA array，后者也适合高通量分析。对于小规模的图谱分析，研究人员十有八九是采用TaqMan miRNA assay，因其灵敏度和特异性俱佳，在miRNA数量不多时绝对是首选。其设计的巧妙创新之处在于Megaplex反转录中的引物并非随机引物，而是靶特异的茎环结构的反转录引物。这个创新设计解决了miRNA定量中的基本问题：成熟miRNA的短序列（~22nt）不允许在反转录反应中使用传统的随机引物。茎环结构提供了仅针对成熟miRNA模板的特异性，并形成引物/成熟miRNA嵌合体从miRNA的3’端开始延伸。产生的较长反转录扩增产物能作为模板，用于标准的实时定量PCR分析。这样，miRNA就可以被扩增了。

因为有了扩增，TaqMan MicroRNA Assay就显得更加灵敏。研究人员只需要极少量的总RNA样品即可。DNA预扩增步骤的引进更显著降低了起始RNA样品量。即使1ng的总RNA，也能产生综合的表达图谱。

TaqMan MicroRNA Array则是将TaqMan MicroRNA Assay的所有优势集合并预装成便利的微流体芯片形式，特别适合人、大鼠和小鼠的图谱分析。它的原理其实很简单，就是384个定量PCR反应集中在一块微流量板上进行。每个阵列的内容与各自的Magaplex Primer Pools匹配，包含最多381个独特的TaqMan MicroRNA Assays，有效缩短了准备时间，并减少实验的不确定性。用Megaplex RT Primers反转录miRNA靶点及用Megaplex PreAmp Primers预扩增之后，TaqMan Universal PCR Master Mix可与每个反应简单混合，并移至TaqMan Array的八个上样口中之一，一个工作日内就能产生覆盖Sanger miRBase的综合数据集。你只需一台7900定量PCR仪和TLDA block就能完成实验。如果没有这些仪器，也可以将整个分析外包给上海生物芯片中心。

更多选择

你也许猜不到，美天旎也推出了一款miRNA芯片，叫miRXplore芯片。别惊讶，美天旎除了金标准的MACS技术，也有着10年的芯片开发经验呢。此款miRXplore芯片是与洛克菲勒大学的顶尖科学家共同设计和验证的，包含了13.0版miRBase中所有人、小鼠、大鼠和病毒miRNA，并有72个对照，包括阳性、阴性对照和杂交对照等。为了让这些小RNA的退火温度一致，美天旎使用了专利的、优化的缓冲液，可以在不同的AT和GC碱基对之间降低退火温度，这样就可以在同一时间灵敏和特异地检测miRNA。

那么如何保证芯片检测的特异性呢？美天旎利用人工错配的miRNA来进行实验。他们将人工错配的miRNA加到肝癌细胞、恶性胶质瘤细胞、海马细胞和CD4+ T细胞的总RNA中，以展示一个或两个错配探针的相对信号强度。结果显示即使在单碱基错配的情况下，交叉杂交信号仍低于10%。因此，miRXplore能够可靠地区别序列相似度高的miRNA家族成员。同时，美天旎也提供miRXplore芯片的技术服务。

另外一些公司也获得了Exiqon LNA技术的授权许可，Luminex就是其中之一。它在第一款FlexmiR产品中使用了LNA，但是它最近改换了一种新方法，不再依赖LNA。这个第2版的FlexmiR Assay凭借xMAP技术的强大优势，能够在单个孔中分析50个不同的miRNA，而无需样品标记或扩增。微小的聚苯乙烯珠上带有生物素化的捕获探针。在miRNA捕获之后，酶去除掉未结合的生物素，并切开所有错配。即使有一个碱基的错配，也看不到信号。整个操作过程从开始到结束只需4-5小时，手工操作时间只有30分钟。

Luminex技术的多重分析能力，对于那些只研究特定miRNA，且一次需分析多个样品的研究人员来说很有用。另外，据Luminex的研发人员介绍，Luminex的产品对植物研究也特别棒，这对我们很多植物研究所而言真是个福音。