荧光定量PCR技术及其应用

荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简要叙述。

一、特点

FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。而FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。实验一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪。

该仪器具有以下特点：

①应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、病原体检测及PCR条件的优化等。

②独特的定量原理：采用荧光标记探针，经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而达到定量目的。

③工作效率高：内置9600型PCR扩增仪，电脑控制1～2小时全自动同步完成96个样品的扩增及定量。

④无须凝胶电泳：无须对样品进行稀释和电泳，只须通过特殊探头在反应管内直接检测。

⑤无管道内污染：采用独特全封闭反应管及光电传导系统，无须顾及污染。

⑥结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。所以自从此项技术研制成功以来，受到许多科研工作者的重视并在多个领域得到应用。

二、原理和方法

FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582nm处），探针的3’开端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。

模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。实验仪器一般使用PE公司研制的ABI7100型 PCR扩增仪，也可用其它PCR仪。如果用ABI7700型反应型反应系统进行实验，反应结束后，通过电脑分析，可直接给出定量结果。如果用其他PCR仪，则需要同时使用荧光探测仪测量反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得出定量结果。由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。

探针设计一般应符合以下条件[2]：

①探针长度应在20～40个碱基左右，以保证结合的特异性。

②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。

③避免与引物发生杂交或重叠。

④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的

Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。

图.TaqMan PCR反应模式 （A）聚合反应；（B）链置换；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，FP：上游引物；RP：下游引物）

三、应用

由于FQ-PCR具有高灵敏性，高特异性和高精确性的特点，目前，该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。

（一）病原体测定

由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。 Morris等[3]用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。测定显示，可测得的样品浓度相当于每毫升13个基因组。与巢式PCR比较显示，FQ-PCR有着与巢式PCR相同的敏感性。另外，还对48例临床丙型肝炎病人血清样品进行了测试，32例样品两种检测方法均为阳性，10例均为阴性；另有6例用两种方法测定的结果不一致。该6例样品又让第三个实验室用巢式PCR方法重新测定，其结果与FQ-PCR测定的结果一致率为100%。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时，由于FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。

与宫颈癌及其癌前病变有关的人类乳头瘤病毒（HPV）有多种类型，以HPV-16、18、31、33、35等类型危险性最高。Swan等[4]1997年用FQ-PCR技术对子宫阴道灌洗标本进行了研究。

他们发现，由于荧光探针的应用，对各型HPV的检测变得十分方便和准确。由于HPV-16的特异引物可以和HPV-66的模板DNA发生错配，用一般PCR方法扩增时，如有HPV-66存在，即可扩增出HPV-66片段而发生误诊，但是HPV-16特异探针的应用使HPV-66在TaqMan系统中不能扩增。因此，FQ-PCR对不同亚型的病毒检测具有高度特异性。同时也发现FQ-PCR具有高度敏感性，用一般PCR方法检测不到的HPV模板浓度在TaqMan系统中却可检测到。对于HPV-16、18、31、33、35类型敏感高达到每100～1000个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组，平均每300个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组。

以前常规检测大肠杆菌的方法，都是采用多种选择性培养基培养分离法，对产志贺氏毒素的大肠杆菌（SLTEC）缺乏特异性，因此这种菌株的检测又费时又困难。后来又有应用抗体的免疫学方法和核酸序列测定的生化方法及以DNA扩增为基础的PCR方法等，都因为繁琐，需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国Witham等[5]1996年将FQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，以提高实验的准确性和精确性。由于TaqMan系统可以一次测量96管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要进行电沪及EB染色后处理过程，实际应用方便，从而提高了实验的参考价值和应用价值。因此该实验方法是食品检测方面的一个突破。此外，加拿大Chen等[6]1997年也把FQ-PCR技术用于食品中沙门氏杆菌的检测研究。

在抗痨治疗开始后，结核病人痰中可持续存在有结核杆菌，为了研究结核病人痰标本DNA定量结果是否与有活力的结核杆菌数量相符合并监测治疗反应，1998年美国Desardin等[7]用FQ-PCR和竞争性PCR两种方法定量检测治疗期间连续收集的结核病人痰标本，结果显示两种方法有较好的重复性和准确性。痰中结核杆菌DNA定量结果与抗酸染色显微镜下计数的结果一致。

（二）肿瘤研究

意大利Gelmini等[2]用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在28～31之间时，△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。为了检验FQ-PCR的准确性和对不同基因拷贝数的分辨率，他们将c-erbB-2基因的DNA样本用正常胎盘DNA做不同倍数稀释后进行实验，测得的结果与期望值高度相关（r=0.997）。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。

1998年法国Bieche等[8]用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本。他们选择扩增频率较高的myc、ccnd1和erbB2基因进行扩增，在108例标本中，发现10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷贝数增加，拷贝数增加的最大值分别为4.6、18.6、15.1。同时他们又将这些数据与Southern印迹的结果进行比较，显示了较好的相关性。

（三）基因表达研究

由于TaqMan系统及荧光探针的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPO）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（ITP）、再生障碍性贫血（AA）和特发性血小板多症（ET）等疾病过程中的病理生理意义，日本Hirayama等[9]用TaqMan EZ RT-PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基质细胞TPO mRNA水平，又用ELISA方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度。结果显示ITP和AA病人TPO mRNA水平明显升高，而ET病人的TPO mRNA水平则正常，经类固醇治疗后ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的浓度与其 mRNA水平有相关性；在正常人和ITP病人，TPO mRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明TPO 的作用提供了依据。日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技术对鼠成肌细胞系C2C12中肌肉调节因子的表达水平及动态变化进行了研究。

（四）免疫组份分析

对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行[11，12]。流式细胞法是通过对细胞群体进行直接而方便的V-β表达方面的研究，但需要一整套单克隆抗体和大量细胞来进行染色分析，而且人类V-β特异性抗体尚不完备，因此该方法有许多不便之处。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量细胞，引物设计也很方便，而且已有多种定量方法，包括锚式PCR法、半定量PCR法、竞争性PCR法等[13，14]，但都因PCR产物的后处理过程需凝胶电泳、EB染色和光密度测量等既费时，又降低了准确性，还增加了污染机会，使得FQ-PCR的应用受到限制。1997年Lang等[15]用FQ-PCR技术进行实验，从而避免了这些问题，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。

（五）基因突变及多态性的研究

美国Ibrahim等[16]1997用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。

（六）其他方面

日本Isono[17]利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因Cab作为内参照，进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。1998年美国Higgins等[18]还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（pla）的实验方法。

四、结语

综上所述，FQ-PCR作为一种核酸定量技术，应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，其优越性在此方面也得以充分体现。因此将该项技术进一步开发应用于临床，具有很大潜力。但是在遗传病和肿瘤研究方面，尤其是基因表达的研究，该技术目前应用的还较少，在此方面加强研究应用，将会有广阔的前景。