Persongen 新型 NK 细胞扩增技术

互联网2015-05-20

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NK细胞又称为自然杀伤细胞，属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，占外周血淋巴细胞的5%~15%，是重要的免疫细胞。科学家在1975年首次鉴定到了NK细胞，这类细胞能够在缺少T、B细胞的情况下直接杀伤肿瘤细胞。与具有细胞毒性的CD8+T细胞不同，NK细胞杀伤肿瘤细胞时不需要预先致敏可以直接杀伤MHC阴性的肿瘤细胞，这使得NK细胞在过继细胞免疫治疗中被广泛应用。但NK细胞在外周血淋巴细胞中所占的比例较低，所以有必要建立一种NK细胞体外扩增技术，用于研究NK细胞的功能并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。

传统的NK细胞扩增技术是在NK细胞培养体系中添加IL2、IL15等细胞因子以促进NK细胞增殖，但由于扩增效率不高且纯度不够未能得到广泛应用。近年来，有人采用基因工程的方法在K562细胞上同时表达IL-15、CD137L 等分子, 并以此细胞来刺激NK细胞的增殖。IL-15和CD137L联合刺激是PBMC 中NK细胞特异性扩增的基础：作为膜蛋白，通过细胞间的接触刺激，用以诱导NK细胞扩增。IL15能够促进NK细胞的分化成熟，而IL21能够联合IL15分子促进NK细胞的分化成熟，所以本研究在稳定表达IL15和CD137L的pAPC细胞上同时表达了IL21分子（图一），经γ射线照射后作为刺激细胞，对其在NK细胞扩增中的作用进行了研究。具体研究结果如下：

pAPC-mbIL21细胞

pAPC细胞是一种经过设计将CD137L和IL-15基因导入细胞，使其在细胞膜上稳定表达CD137L和IL-15分子的工程细胞，由博生吉公司构建和提供。pAPC-mbIL21（pAPC-membrane binding IL21）是利用病毒表达系统将IL21分子表达在pAPC细胞膜上(图二)，左图为同型对照。γ射线照射过的pAPC-mbIL21细胞用于刺激NK细胞扩增。辐照过的细胞在3-6天保持细胞原有形状，与PBMC混合培养后，照射细胞会在6-7天破碎并被吞噬干净。

<center> <img src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2015/05/A1432109069_small.jpg" /></center>

图1 NK细胞扩增原理

图2 IL21在pAPC细胞表面表达

NK细胞形态特征

刚分离出来的健康人PBMC大小不一，折光性一致，悬浮生长。当实验组加入工程细胞pAPC-mbIL21和IL2培养后，工程细胞pAPC-mbIL21周围会有细胞集落，细胞扩增起来后，可明显观察到细胞大小均匀，数目较多。

不同浓度IL2对NK细胞扩增表型的影响

IL2对NK细胞的活化和分化具有正调节作用。经验证，60IU/ml能够很好的诱导NK细胞的分化增殖。文献报道，IL2在浓度120IU/ml时也能够高效的诱导NK细胞的扩增。所以，我们又加设一组IL2终浓度为120IU/ml。第七天时，NK细胞扩增不明显，故在第十天时计数并进行了流式分析。结果发现，经不同浓度IL2扩增后，第10天低浓度IL2组和高浓度IL2组NK细胞纯度分别为86.96%和82.39%（图三）；第28天分别为96.33%和95.28%，两组最终得到的NK细胞纯度差异不大。综合来看，60IU/ml组能够扩增出略高比例的NK细胞。
<center> <img src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2015/05/B1432105217_small.jpg" /><br /> 图3 不同浓度IL2对NK细胞表型影响分析 <p> 不同浓度IL2对NK细胞扩增倍数的影响</p> </center>

图4 不同浓度IL2对NK细胞扩增倍数影响

IL2能够促进NK细胞的增殖，本实验在IL2 终浓度60IU/ml的基础上加设一组120IU/ml。扩增结果显示，pAPC/IL21 在IL2终浓度60IU/ml时能够达到很好的扩增效果。第十天时，pAPC-mbIL21（60IU/ml）组和pAPC-mbIL21（120IU/ml）组可分别扩增至36.61和32.02倍，而pAPC（60IU/ml）组扩增至24.90倍（图四）。当扩增至二十八天，各组分别扩增至1118.2、967.76和350倍。由NK细胞扩增倍数结果可知，选用pAPC-mbIL21作为刺激细胞且联合IL2终浓度在60IU/ml时能够高效的扩增出NK细胞。

图5 21天不同样本NK细胞扩增结果

NK细胞免疫表型分析

图6 NK细胞纯度检测

第 0 天时分离血液中 PBMC ，用 CD3-FITC 、 CD56-APC 进行荧光染色，并通过流式细胞术对初始细胞表型进行分析，流式分析图中上侧为 CD56 + 细胞群，右侧为 CD3 + 细胞群。从图中可知，样本三经 pAPC-mbIL21 联合 IL2 终浓度 60IU/ml 扩增 28 天后， NK 细胞纯度可达 86.76% （图六）。

杀伤实验结果

从四名志愿者血液中提取初始 PBMC ，按照上述方法对 NK 细胞进行扩增。细胞扩增 21 天后，随机取一组 NK 细胞进行肿瘤细胞体外杀伤实验，初步验证扩增到的 NK 细胞的功能。选取 K562 和 RPMI-8226 作为靶细胞，效靶比为 5:2 和 5:1 时进行杀伤实验。杀伤时间为 4h 。结果如图七， NK 细胞对 K562 细胞杀伤率为 76.7% 和 85.2% ， NK 细胞对 RPMI-8226 细胞杀伤效率分别为 50.8% 和 63.3% 。不加效应细胞组， K562 自然死亡率为 7.8% ， RPMI-8226 自然死亡率为 3.7% 。

图7 NK细胞对肿瘤细胞杀伤效率

讨论与分析

病毒感染或者肿瘤发生的发病机制主要是由于机体的免疫能力无法战胜病原微生物或清除肿瘤细胞所致。NK细胞在抗病毒、抗肿瘤中扮演了重要的角色，因其作用不需初次免疫活化，因此在过继免疫治疗中有很大的应用前景。有文献研究了可溶性的IL2、IL15及饲养细胞可刺激NK细胞的扩增，但其扩增倍数较低。也有文献报道，经膜结合型IL21刺激扩增的NK细胞端粒长度增长，能够在体外更长时间维持NK细胞的扩增。所以本文研究了一种改良型的NK细胞体外扩增技术，该技术应用了一种表达了NK细胞分化成熟所必需的CD137L、IL15、IL21等分子的工程细胞，该细胞在辐照后能够作为饲养细胞在体外诱导NK细胞的分化成熟。

我们先比较了不同浓度IL2（60IU/ml和120IU/ml）对NK细胞扩增倍数及纯度的影响，之后又按此浓度对四个正常人样本进行了扩增，均达到了较好的扩增效果，其中有一个样本NK细胞扩增不太理想，扩增至21天时纯度仅达到64.87%，扩增倍数仅为73.21倍，可能是因为个体差异性，这种个体差异性在其它文献中也有出现过，至于出现这种个体差异性的原因有待进一步研究,分析可能是不同样本NK细胞表面激活受体或抑制受体表达呈现一个特殊性。四个样本PBMC中NK细胞比例分别为23.38%、24.70%、10.59%、9.22%，前两个样本NK细胞比例较高，样本四NK细胞占比例较低，这也可能是扩增倍数出现差异的原因。

为了检测扩增得到的NK细胞的功能，我们选择了K562和RPMI-8226。相同效靶比时，NK细胞对K562的杀伤活性比RPMI-8226要高。RPMI-8226高表达HLA-1分子，对NK细胞的杀伤作用起到了抑制作用。有研究表明，运用单克隆抗体阻断RPMI-8226细胞HLA-1分子表达能够显著提高NK细胞对其杀伤效果:效靶比20:1时，杀伤率由阻断前的（13.14±4.44）%提高到阻断后的（62.17±8.73）%。然而，在不阻断RPMI-8226细胞HLA-1分子表达的情况下，本文方法扩增的NK细胞能够在更低的效靶比（5:1）情况下对其获得更高的杀伤效果（63.3%）。

与其它细胞因子扩增NK细胞法相比，博生吉自主研发的扩增方法避免了加入细胞因子，更简单、经济、有效且扩增倍数较高。实验结果证明，这种基于mbIL21的改良型NK细胞扩增技术即选用pAPC-mbIL21作为刺激细胞，IL2终浓度在60IU/ml，能够高效扩增出纯度和杀伤活性都较高的NK细胞，从而为NK细胞的免疫治疗奠定了基础。

本文章由博生吉医药科技（苏州）有限公司提供