双歧杆菌的分离、培养及鉴定

园友sakuyaandy：

我们培养双歧杆菌是在厌氧培养箱中进行培养，如果没有的话，用厌氧瓶或厌氧缸都可以。培养基你用的是怎么改良的呢?我们是在MRS里面加入了L-半胱氨酸,不过这都是培养用的培养基,如果你需要区分菌落可以用X-GAL改良MRS可以起到鉴别做用，具体文献名称为

园友jerrycs：

厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长。其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。

该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。

双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。

以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。

目前，双歧杆菌鉴定的方法有很多种。近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建，分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性；RAPD技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型。一般来讲，我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法，主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等。

实验用具

高纯氮气 厌氧管 注射器 培养箱 冰块 水浴锅 镊子 记号笔 MRS培养基 细菌生化微量鉴定管 酒精棉球 瓷盘 振荡器 铜柱除氧系统 定量加样器 恒温水浴 载玻片 显微镜 恒温培养箱 超声波破碎仪 滤纸 层析缸 酒精灯 封口膜 厌氧罐 等。

实验方法与步骤

1铜柱系统除氧

铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。

2预还原培养基及稀释液的制备

制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。

3分离

（1）编号

取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。

（2）稀释

在无菌条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-7，制成不同样品稀释液。通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管计数。

（3）滚管分离

1）滚管

将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。

2）分离

生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养。培养24h或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。

4计数并镜检

（1）计数

液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有的双歧杆菌数量。公式如下：

双歧杆菌数量cfu/g（mL）样品=0.1mL滚管计数的实际平均值×10×稀释倍数

（2）镜检

挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。

5菌种鉴定

（1）双歧杆菌特定酶的检测

利用果糖-6-磷酸盐对分离得到的菌种进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）的测定，初步确定菌种是否为双歧杆菌属。F6PPK测定的操作如下：

①将从样品中分离出的双歧杆菌培养于厌氧液体改良MRS培养基中37℃生长24 h。

②将菌液4400 rpm离心10 min,收集菌体，缓冲液ⅰ洗涤2次，最后溶于约4 mL缓冲液ⅰ中，制成细菌悬液。

缓冲液ⅰ：现用现配。取0.05 M Na2HPO4 31.5 mL和0.05 M NaH2PO468.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-盐酸盐。

③用超声波粉碎仪，400 W条件下；每处理5 s、间隔5 s,超声粉碎8 min，至菌体溶液呈半透明。

④破碎后，取0.5 mL于离心管中，加试剂ⅱ和ⅲ各125 µL,37℃保温30 min。

ⅱ6 mg/mL氟化钠加10 mg/mL碘乙酸钠。

ⅲ果糖-6-磷酸盐80 mg/mL水溶液。

⑤加试剂ⅳ0.750mL,室温10 min。

ⅳ现用现配。盐酸羟胺139 mg/mL。酸性极强，用氢氧化钠中和至pH6.5。

⑥加试剂ⅴ和ⅵ各500 µL,室温5 min。

ⅴ三氯乙酸（TCA）水溶液15 g/100 mL。

ⅵ4 M HCl。

⑦加试剂ⅶ500 µL,显色。红褐色或红紫色为阳性，黄色为阴性。

ⅶ0.5 g/100 mL FeCl3·6H2O溶于0.1 MHCl。

（2）乙酸、乳酸等有机酸的测定——纸层析法

①层析滤纸的制备——将层析滤纸剪成1.5cundefined11cm的长条状，在距层析纸一端约4cm处用铅笔划线确定点阳线，使用前充分干燥。

②配制展开剂——正丁醇:甲酸:水=80:15:5

③配制标准液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液

④制备待测样品——将菌种37℃培养24h后离心，收集上清液

⑤点样——用毛细管分别吸取发酵液，多次点样于滤纸条上，样点直径不宜超过2mm，平衡2h

⑥层析——将点好样的层析纸放入，使点有样品的一端浸在展开剂中，但不可浸及样点。观察展开情况，待展开剂前沿到达离层析纸另一端约1.5cm处，取出层析纸。

⑦ 显色——以3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸喷洒并计算Rf值。

注释：物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值Rfvalue又称Rf值)来表示：

Rf=原点到层析中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关，是一个定性分析的重要参数。

（3）糖发酵试验

糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

本实采用现成的细菌生化微量鉴定管 ，鉴定管的种类如下：

乳糖 麦芽糖 甘露糖 甘露醇 蔗糖 阿拉伯糖D-核糖 木糖（木胶糖） 半乳糖 松三糖 山梨糖 淀粉 水杨素 葡萄糖酸盐 草糖（海藻糖） 血清菊糖 棉子糖 果糖 蜜二糖 纤维二糖

具体实验步骤：

① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

③24h后观察各管中液体变颜色情况，若变色则为阳性，反之阴性，对照凌代文编著的《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》“鉴别双歧杆菌属内种的特征”表即可初步确定其种别。