琼脂糖凝胶电泳介绍

主要试剂：

核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解。

核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有：

1) TBE：0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/l EDTA

2) THE：0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/l EDTA

主要实验步骤：

1、 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子。

2、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。

3、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

4、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。

倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

琼脂糖浓度的配置可参照下表：

5、 样品制备与加样：溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料（0.025%溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10%-15%）或甘油（5%％-10%），也可使用2.5%Fico Ⅱ增加比重，使样品集中，每齿孔可加样5-10μg。

6、 电泳：一般电压为5-15V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm。电泳过程最好在低温条件下进行。

7、 样品回收：电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收，如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶，将其装入透析袋（内含适量新鲜电泳缓冲液），扎紧透析袋后，平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中，100V电泳2-3小时，然后正负电极交换，反向电泳2分钟，使透析袋上的DNA释放出来。吸出含DNA的溶液，进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。

注意事项：

1、 加热时, 一定要煮沸, 以保证琼脂糖的完全溶解。

2、 ?待溶液冷却至不烫手, 感觉温暖舒适时加EB. 一定要在通风柜里。

3、 倒胶时, 可用干净的纸巾拭去气泡。

4、 胶凝固后先倒入些电泳缓冲液以方便取梳子。

5、 保证缓冲液淹过胶的边沿, 边沿部分常高出1-2mm。

6、 有时需要大的上样孔, 可用胶带把几个相邻的梳齿粘在一起, 这种情况下, 尽量让胶液冷一些再倒胶。

7、 如果只是为了看一下结果(不需要照相), 同一块胶可重复用1-3次. 有一次我跑了4遍, 条带很弱, 用加了EB的缓冲液(约10μ| EB in 50ml 缓冲液)泡半小时后就如正常了。

8、 要保存胶到第二天用, 可以保鲜膜包裹后放入4 度冰箱。

9、 TAE 电泳缓冲液也可重复使用, 至少10次没有问题。

10、 为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液，混匀后再用。