粗糙链孢霉的分离和交换

【实验目的】
1.用粗糙链孢霉的赖氨酸缺陷型和野生型进行杂交，并观察杂交所得后代的子囊孢子的分离和交换现象。
2.掌握顺序排列四分体的遗传学分析方法，进行有关基因与着丝粒距离的计算和作图，加深理解基因分离和连锁交换规律。

【实验原理】
粗糙链孢霉(Neurospora crassa，2n＝14)，又称红色面包霉，在分类学上属于真菌中的子囊菌纲、球壳目、脉孢菌属，目前已知有4～5种。

利用粗糙链孢霉进行遗传学分析有如下优点：①个体小，生长快，容易培养；②既可进行有性繁殖，又可进行无性繁殖，一次杂交可产生大量后代；③染色体与高等生物一样，研究结果可广泛应用于遗传学上；④无性世代是单倍体，没有显隐性，基因型可以直接在表型上反映出来；⑤一次只需分析一个减数分裂的产物，就可以观测倒遗传结果，简单易行，而二倍体合子是两个不同减数分裂产生的配子相互结合的结果，需要通过测交实验才能分析减数分裂的结果，手续麻烦。因此粗糙链孢霉是进行基因分离和连锁交换遗传分析的好材料。

粗糙链孢霉的营养体是由单倍体（n＝7）的多细胞菌丝体和分生孢子所组成，生活方式由有性和无性两种。菌丝经有丝分裂直接发育成菌丝体，称无性生殖。而两种不同接合型细胞结合产生有性孢子的过程称有性生殖。 无性繁殖过程，由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子有两种，小型分生孢子中只含有一个核，大型分生孢子有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可以再生成分生孢子，周而复始（见下图）。

粗糙链胞孢霉的生活史
1- 3 为无性繁殖；4-9 为有性繁殖。图中间示基因交换发生位置及子囊 孢子的排列顺序，（1）（2）为非交换型；(3)（4）（5）（6）为交换型。

在有性生殖过程中，粗糙链孢霉的菌株有两种不同接合型(mating type)，它们受一对等位基因控制。不同接合型菌株的细胞接合产生子囊果及子囊孢子。

粗糙链孢霉的子囊孢子是单倍体细胞，由它发芽长成的菌丝体也是单倍体。所以由一对等位基因决定的性状在F1就能分离。并且，它的一次减数分裂产物包含在一个子囊中，可以直接观察到基因分离，并证明基因在染色体上。同时，再一次有丝分裂后，8个子囊孢子有顺序地排列在子囊中，就可以测定着丝粒距离和发现基因转变。

交换型子囊的出现，是由于核基因与着丝点之间发生了一次染色体片段的交换的结果，即由第一次分裂分离形成的子囊为非交换型子囊，第二次分裂分离形成的子囊为交换型子囊，因而第二次分裂分离的子囊数量愈多，表明有关基因和着丝粒的距离愈远。根据第二次分裂分离子囊的频数，就可以计算出某一基因和着丝粒间的距离，这距离称为着丝粒距离。由于交换只发生在二价体的4条染色单体中的2条之间，当每发生一次交换时，便产生一个第二次分裂分离子囊，所以交换型子囊中仅有一半子囊孢子属于重组类型，因此必须将第二次分裂分离子囊的百分率除以2，就是某一基因与着丝粒间的重组值，计算公式如下：

【实验仪器、材料和试剂】
粗糙链孢霉野生型菌株(Lys+)，赖氨酸缺陷型菌株(Lys-)。

【方法与步骤】
一、菌种活化
进行杂交实验前，要先把冷冻保存的菌种活化。把野生型和缺陷型菌种分别斜面接种到各自的试管培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养5—7天，直至菌丝上部有分生孢子产生，长好的菌株在菌丝上部可见红粉状孢子。保存和活化可用马铃薯培养基。

二、接种杂交
在无菌条件下，先将接种环挑取lys-菌株的菌丝或分生孢子，团块直径约3—6mm，接种于杂交培养基上，再挑取Lys+菌株的菌丝或分生孢子，团块直径约1—2mm，接种在同一杂交培养基上，让其杂交。接种时，试管口应靠近火焰，以防污染，并贴上标签，然后放在25℃恒温培养箱中培养，约经14天左右，可看到棕黑色的成熟子囊，此时即可在显微镜下观察分析。

观察时要注意掌握好孢子的成熟程度，如过早，子囊中的孢子尚未成熟而呈白色，若偏迟，则孢子全为黑色，对交换型和非交换型孢子难于区别。要掌握适宜的观察时期，最好是在子囊壳开始变黑时，每天取几个子囊果压片观察，当看到适合时即置于4～5℃冰箱中，可保存3～4周，延长观察时间。

三、压片观察
将附有子囊果的滤纸条放入3％来苏尔溶液中处理10min，杀死孢子，以防孢子飞扬污染实验室。取一载波片，滴一滴3％来苏尔溶液，然后用接种针跳出子囊果放在载波片上，用镊子柄平压，或盖上另一载波片，用手指压片（这里用载波片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，盖玻片易破裂），压片时要适当用力压破子囊果，使子囊呈放射状逸出，但要注意不能让分生孢子散出，一个子囊果中会散出30～40个子囊。压片时最好一次一个子囊果，多了压不好。

片子压好后，置于100×显微镜下观察，观察时要顺时针方向观察，自中心向外确定子囊类型，计数并做好记录。此过程不需无菌操作，但也要注意对观察过的载玻片，用过的镊子和解剖针等用具都需放入来苏尔溶液中浸泡后取出洗净，以免污染实验室。