各种色谱的主要影响因素

一、凝胶过滤色谱：

一般来说，凝胶过滤色谱的结果好坏直接取决于凝胶柱的柱效（每米多少理论塔板数），而影响柱效的因素主要有：

1、凝胶本身性质：

每一种凝胶均有其合适的分离范围，应选择合适的凝胶进行分离。同样分离范围的凝胶颗粒越细的，柱效越高。

2、色谱柱装填的好坏：

凝胶过滤色谱柱装填完后，一般可以用丙酮（或NaCl）测定柱效和峰对称性，一般对于平均颗粒直径在30~34微米的Superose PG、Superdex PG系列凝胶，柱效应在9000以上，而颗粒平均直径在90微米的Sepharose FF凝胶柱效应在3000以上。通常，越是分辨率高的细颗粒凝胶对于装柱的技术要求越高。

除了柱效以外，影响分离的因素主要有：

a、色谱柱的长短，一般较长的柱分离较好，L/D>20。但一般商用色谱空柱长100cm左右，最多可以装到90~95cm高左右，如果仍不能取得满意的分辨率，可以用两根相同的凝胶柱，用SRTC-2接头连接后，可以提高分辨率40%。

分离度正比于柱长的平方根。

b、样品浓度，在蛋白浓度小于50mg/ml并且粘度小于5cP（厘泊）的条件下，样品浓度对于分辨率影响较小。

c、上样体积：

上样体积越小分辨越好，不同的凝胶具有不同的推荐上样体积，如下表：

凝胶类型 推荐上样体积（%Vt）

Sephadex 2-5%

Sepharose 2-5%

Sephacryl HR 1-2%

Superdex PG 1-2%

Superose PG 1-2%

Superdex 0.5%

Superose 0.5%

对于利用Sephadex G25进行蛋白质脱盐的特殊情形，样品量达到柱体积的25%仍可以保证蛋白与盐分开。

d、洗脱流速：

一般较低的流速下（5~10cm/h）分辨率较高，但Superdex PG，Sepharose FF等新型凝胶可以在较高的流速下分离而不致损失分离度。

二、离子交换色谱：

a、凝胶本身的性质：

分辨力 Sepharose FF<sepharose></sepharose>

DEAE：弱阴离子 Q：强阴离子 选择性有差异

CM：弱阳离子 S：强阳离子 选择性有差异

b、工作缓冲液的pH值：

离子交换依赖于分子所带的电荷，故pH对其影响较大，往往0.2~0.5 pH的改变就足以改变色谱结果，具体对于分离某一种蛋白，那一个pH最合适，需要进行大量的实验摸索。

c、上样量：

一般保持在结合最大容量的20%以下可以获得较好的分辨率。但对于样品体积无限制。

d、梯度形状：

梯度越平缓，分辨率越高，但同时样品越稀。

c、流速：影响不大。