细胞计数及活力测试操作步骤

一、原理

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）
2、试剂：0.4%台盼兰，0.5%四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇
3、材料：细胞悬液

三、操作步骤

（一）细胞计数

　　1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
　　2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
　　3、静置3分钟。
　　4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
　　　然后按本式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000
　　注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

（二）细胞活力

　　1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
　　2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。
　　3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
　　4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

（三）MTT法测细胞相对数和相对活力

1、活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

　　(1) 细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。
　　(2) 沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。
　　(3) 37℃下保温2小时。
　　(4) 加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。
　　(5) 1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。
　　注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
　　附：1、0.4%台盼兰染液配制： 台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml。

2、MTT配制：
　　MTT0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。

3、酸化异丙醇配制：
　　异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。