13种蛋白浓缩方法的应用过程需知

互联网2013-08-27

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1、丙酮沉淀法：三氯醋酸沉淀法试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。

2、免疫沉淀法：得有特异性抗体

3、硫酸铵沉淀法：利用高浓度盐将蛋白质析出(盐析)，选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济，大多数的蛋白都可以用资格方法

4、聚乙二醇沉淀法：使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性!他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀!

5、离子交换层析：可用阴离子交换树脂进行浓缩。

6、透析袋浓缩法：利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋(无透析袋可用玻璃纸代替)，结扎，把高分子(6 000-12 000)聚合物如聚乙二醇(碳蜡)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30%-40%浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。

主要用于更换蛋白质的缓冲液，得有透析袋。不需要特殊的仪器。一般用得是PEG20000进行实验，简单，快速，对蛋白没什么影响

7、冷冻干燥浓缩法：这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内(干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等)。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。

8、吹干浓缩法：将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15 ℃。

9、超滤膜浓缩法：此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤;另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。

10、凝胶浓缩法：选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。

11、浓缩胶浓缩法：浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120 ml～150 ml。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后，蛋白质的回收率可达80%～90%。比浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。

12、盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。如硫酸铵沉淀法。

13、有机溶剂沉淀法：有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。

该法优点在于：
（1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀;

（2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易;

（3）在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。

总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。

有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。

有多种因素影响有机溶剂的沉淀效果：

（1）温度：低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶解度，提高提取效率;

（2）样品浓度和PH：与盐析法中的作用基本相同;

（3）金属离子：一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定PH下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白质的生物活性。

（4）离子强度：盐浓度太大或太低都对分离有不利影响，对蛋白质和多糖而言盐浓度不超过5%比较合适，使用的乙醇量不超过二倍体积为宜。

强调低温(0-4度以下)是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性，可用乙醇，丙酮……注意：Mg离子，pH值

有机溶剂沉淀法不如盐析法应用普遍，温馨提示：在十度以下的条件下，蛋白质会在有机溶剂中变性，这时要注意选用合适的有机溶剂：如乙醇，丙酮，还有，注意：镁离子和pH值。