电子显微镜检测法检测细胞凋亡

具有凋亡特征的细胞程序性死亡后，可在扫描或透射电镜下观察到“凋亡小体”，该小体系由细胞膜卷曲、脱落形成的小泡，其内包含有完整的细胞器及核片段。这种小体易被巨噬细胞、上皮细胞等吞噬，借以清除正常发育过程中死亡的细胞。细胞坏死则无此小体形成。但是并非所有发生程序性死亡的细胞皆形成凋亡小体。

一、仪器与试剂

射电子显微镜或扫描电子显微镜，组织切片机，离心机，离心涂片机。

戊二醛固定液：取25%戊二醛原液10ml，加入0.2mol/L PBS液50ml，再加入蒸馏水40ml，混匀，4℃保存。

锇酸固定液：将含有1g锇酸的小瓶浸入清洁液过夜，用双蒸水冲洗数遍后，将小瓶放在盛有50ml双蒸水的100ml棕色磨口瓶内，击破锇酸小瓶使其内锇酸溶于水，1～5ml小瓶分装，避光，4℃保存。用时再稀释1倍成1%的应用液。

二、操作步骤

离心收集约5×10⁶ 细胞，用PBS洗涤两次后，弃上清，加1ml 2.5%戊二醛悬浮细胞，移入1.5ml Ep管中，室温下4 000r/min离心15min，固定细胞0.5～1h；

在磷酸缓冲液里漂洗1～2h或更长时间，尽量将戊二醛冼净，用1%的锇酸固定液固定30min～1h；

固定完毕后加入50%乙醇脱水10min→70%乙醇10min→90%乙醇10min→90%丙酮10min→100%丙酮三次各10min；

丙酮与环氧树脂1:1包埋2h，再放入纯包埋剂（环氧树脂包埋全浸透）数小时或过夜；

环氧树脂包埋，62℃烤箱二天，进行超薄切片，用醋酸铅铀双染法进行切片染色；

在透射电子显微镜下观察细胞形态、细胞质及细胞核的变化，照相并记录实验结果；

三、结果判断

电子显微镜是观察细胞形态最好的方法，细胞核和细胞器的结构清晰易辨。凋亡细胞染色质固缩并凝结成块，聚集在核膜周边呈新月状或环状小体，细胞浆浓缩，内质网变疏松并与胞膜融合，形成一个个空泡，线粒体结构无明显改变。

细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。坏死细胞的染色质稀疏呈细颗粒状，分布无规律，边界不清，细胞浆肿胀，细胞器结构破坏，细胞膜不完整。