基因细胞内导入技术

一、基本概念

（一）基因导入(或基因转导)

将外源性基因(或基因组DNA)采用分子生物学技术人工地导入细胞，观察它在细胞中的表达，研究其生物学特性和功能，这种把基因导入细胞中的技术称为基因转导(gent transfer)或称基因转移，也简称为导入。是研究基因表达、结构和功能的重要研究手段。

（二）基因转导的种类

目前基因转导技术很多，可根据研究目的、对象和实验条件加以选择。

1、染色体转导：将染色体(甚至是全套染色体)和分离提取的细胞核或DNA大分子片断，可采用细胞融合或细胞显微注射法将染色体或染色体片断导入细胞内并与受体细胞(或称宿主细胞)发生DNA整合，研究整合的细胞特性和功能，这种转导称为染色体转导，这项技术在细胞融合和单克隆抗体杂交瘤技术中已介绍，本章从略。

2、基因转导：将已克隆到的目的基因（或基因的DNA片断或序列），转导入离体细胞中进行表达的方法称基因转导，它有两类：一类是将目的基因转导入体外培养的细胞，另一类是导入从体内取出的细胞中，观察目的基因在细胞中表达，这项技术称基因转染(gene transfection)。

体外培养的人体细胞可以是已建立的细胞系(株)包括二倍体正常细胞。如同体内细胞，如淋巴细胞、LAK细胞、TIL细胞等，基因导入后再回输体内，已用于基因治疗(gene treatment)，另一类是将已克隆化的目的基因导入受精卵，导入基因后的受精卵植入子宫，发育成胚胎和个体，可在胚胎期和出生后观察目的基因在整体内的表达，此项技术称转基因技术（transgenic technique），转基因技术所产生的动物称转基因动物(transgenic animal)。

基因转染的方法常用磷酸钙法、脂质体介导法、电击法(电穿孔技术)、DEAE葡聚糖法、细胞显微注射法等，这均属于物理、化学方法的转基因技术，此法转入至细胞内的基因一般均不与细胞染色体发生整合，而是在细胞质呈现暂时性表达，但不持久，随时间推移而逐渐减弱或消失，为了使目的基因进入细胞后能与细胞基因组DNA发生整合、产生永久性的表达，常用病毒载体将目的基因导入细胞，并发生整合，如用逆转录病毒、疱疹、腺病毒等改建的病毒载体、因此基因细胞内转导技术可归纳如下：

细胞融合技术

染色体转导

染色体转导(显微注射法)

基因细胞内转导

基因转染 磷酸钙沉淀法、电击法、脂质体法、

(体细胞)显微注射法、逆转录病毒等病毒介导法

基因转导

转基因技术(生殖细胞)

（三）目的基因和受体细胞选择

1、目的基因的选择

从基因来说，存在有功能性基因和诱发细胞转化的基因及使癌细胞发生逆转分化的抑癌基因，功能性基因表达时能产生特定的功能性蛋白，如细胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2～IL-18、TNFα、CSFS、EPO、TPO等有功能性基因可选用来进行基因制药。另一类是诱发转化的基因，可诱生细胞发生无限制增殖，发生永生化和恶性化的细胞转化，因此细胞转化试验应选用癌基因或原癌基因。还有一类基因可以诱导细胞分化，使肿瘤细胞逆转向正常细胞分化。因此在研究对肿瘤细胞诱导分化时，应选用抑癌基因。细胞培养已成为研究基因、癌基因和抑癌基因表达的重要手段。

2、受体细胞的选择

不同的受体细胞对导入后基因表达有很大影响，同样的目的基因进入不同的受体细胞中表达能力差异较大，有的为高表达，有的呈现低水平表达，有的甚至不能表达，如β-球蛋白基因在导入MEL14(ATCC、HB132)细胞中能促进细胞发生分化，具有高表达功能，但导入HELA细胞中却无表达，因此受体细胞的选择也应引起关注。基因导入细胞后的表达与受体细胞性状、细胞种类和细胞来源密切相关。

此外，若目的在于获取瞬时表达效果可采用磷酸钙沉淀法、电击法、脂质体法等；若目的要获取永久性稳定表达应选用逆转录病毒等病毒载体导入法。下面介绍几种常用基因转染方法。

二、物理化学法基因转染技术

(一)磷酸钙-DNA共沉淀法

核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2PO4、2H2O

加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L

注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2、操作步骤：

(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。