基因细胞内导入技术

一、基本概念

（一）基因导入(或基因转导)

将外源性基因(或基因组DNA)采用分子生物学技术人工地导入细胞，观察它在细胞中的表达，研究其生物学特性和功能，这种把基因导入细胞中的技术称为基因转导(gent transfer)或称基因转移，也简称为导入。是研究基因表达、结构和功能的重要研究手段。

（二）基因转导的种类

目前基因转导技术很多，可根据研究目的、对象和实验条件加以选择。

1、染色体转导：将染色体(甚至是全套染色体)和分离提取的细胞核或DNA大分子片断，可采用细胞融合或细胞显微注射法将染色体或染色体片断导入细胞内并与受体细胞(或称宿主细胞)发生DNA整合，研究整合的细胞特性和功能，这种转导称为染色体转导，这项技术在细胞融合和单克隆抗体杂交瘤技术中已介绍，本章从略。

2、基因转导：将已克隆到的目的基因（或基因的DNA片断或序列），转导入离体细胞中进行表达的方法称基因转导，它有两类：一类是将目的基因转导入体外培养的细胞，另一类是导入从体内取出的细胞中，观察目的基因在细胞中表达，这项技术称基因转染(gene transfection)。

体外培养的人体细胞可以是已建立的细胞系(株)包括二倍体正常细胞。如同体内细胞，如淋巴细胞、LAK细胞、TIL细胞等，基因导入后再回输体内，已用于基因治疗(gene treatment)，另一类是将已克隆化的目的基因导入受精卵，导入基因后的受精卵植入子宫，发育成胚胎和个体，可在胚胎期和出生后观察目的基因在整体内的表达，此项技术称转基因技术（transgenic technique），转基因技术所产生的动物称转基因动物(transgenic animal)。

基因转染的方法常用磷酸钙法、脂质体介导法、电击法(电穿孔技术)、DEAE葡聚糖法、细胞显微注射法等，这均属于物理、化学方法的转基因技术，此法转入至细胞内的基因一般均不与细胞染色体发生整合，而是在细胞质呈现暂时性表达，但不持久，随时间推移而逐渐减弱或消失，为了使目的基因进入细胞后能与细胞基因组DNA发生整合、产生永久性的表达，常用病毒载体将目的基因导入细胞，并发生整合，如用逆转录病毒、疱疹、腺病毒等改建的病毒载体、因此基因细胞内转导技术可归纳如下：

细胞融合技术

染色体转导

染色体转导(显微注射法)

基因细胞内转导

基因转染 磷酸钙沉淀法、电击法、脂质体法、

(体细胞)显微注射法、逆转录病毒等病毒介导法

基因转导

转基因技术(生殖细胞)

（三）目的基因和受体细胞选择

1、目的基因的选择

从基因来说，存在有功能性基因和诱发细胞转化的基因及使癌细胞发生逆转分化的抑癌基因，功能性基因表达时能产生特定的功能性蛋白，如细胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2～IL-18、TNFα、CSFS、EPO、TPO等有功能性基因可选用来进行基因制药。另一类是诱发转化的基因，可诱生细胞发生无限制增殖，发生永生化和恶性化的细胞转化，因此细胞转化试验应选用癌基因或原癌基因。还有一类基因可以诱导细胞分化，使肿瘤细胞逆转向正常细胞分化。因此在研究对肿瘤细胞诱导分化时，应选用抑癌基因。细胞培养已成为研究基因、癌基因和抑癌基因表达的重要手段。

2、受体细胞的选择

不同的受体细胞对导入后基因表达有很大影响，同样的目的基因进入不同的受体细胞中表达能力差异较大，有的为高表达，有的呈现低水平表达，有的甚至不能表达，如β-球蛋白基因在导入MEL14(ATCC、HB132)细胞中能促进细胞发生分化，具有高表达功能，但导入HELA细胞中却无表达，因此受体细胞的选择也应引起关注。基因导入细胞后的表达与受体细胞性状、细胞种类和细胞来源密切相关。

此外，若目的在于获取瞬时表达效果可采用磷酸钙沉淀法、电击法、脂质体法等；若目的要获取永久性稳定表达应选用逆转录病毒等病毒载体导入法。下面介绍几种常用基因转染方法。

二、物理化学法基因转染技术

(一)磷酸钙-DNA共沉淀法

核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2PO4、2H2O

加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L

注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2、操作步骤：

(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。

(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备:

①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒。

③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。

(4)转染受体细胞:

①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。

②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。

③置37℃ 5% CO2培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。

④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。

⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。

⑥培养大约3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3～4天更换一次选择培养基。

⑦2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行克隆化和扩大培养，可建立转化细胞株，并做进一步鉴定。

本实验要加入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”，也可测出转入的外源性基因的抗neo的标记。而且还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株。若以获取“转化灶”为目的，可不加入PSV2-neo DNA只需将从癌细胞中提取的基因组DNA导入受体细胞即可，其方法如下：

3、基因组DNA转染[方法二]：

(1)配制磷酸转染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用时现配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na2HPO4 0.099g 消毒灭菌 -20℃贮存备用

加温水至 1000mL

(2)按前面介绍的方法提取癌细胞基因组DNA。

(3)取供体基因组DNA50～100μg,加3M NaCl或醋酸钠，使最终浓度至0.3M混匀。

(4)再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10分钟，去上清。

(5)加入转染缓冲液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含最终浓度为125mM，用吸管轻轻吹打三次(不用搅拌器以防DNA袢结)，置室温下10～30分钟，待液体透明度降低，出现微浊兰色时，即可用于转染细胞。

(6)取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞，在转染前4小时，更换培养液(5ml/瓶)1次。

(7)转染：向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小时。

(8)培养：弃去培养液，用15%甘油处理3分钟，无血清培养漂洗1次，接近汇合时血清用量降至5%，培养2～3周。

(9)检测：逐日观察，待出现“转化灶”后，克隆分离，扩大培养建立转化细胞株。

(二)脂质体介导DNA转染法

脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2～24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。

细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

1、操作步骤[方法一]：

(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%～60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2)转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL,轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。

(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

2、快速脂质体转染法操作步骤[方法二]：

(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50～60%板底面积。

(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：

①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。

②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。

③室温下放置5～10分钟，使DNA结合在脂质体上。

(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3～5小时。

(4)再于每孔中加入20黃的DMEM，继续培养14～24小时。

(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10黃的DMEM，2mL/孔，再培养24～48小时。

(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

 稳定的脂质体转染方法如下：

 (1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。

 (2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。

 (3)在每孔中加入1mL、20黃的DMEM，37℃培养48小时。

 (4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。

 (三)DEAE-葡聚糖转染法

 DEAE-葡聚糖介导的转染，其原理还不清楚，可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验，转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系，可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间(30分钟-1.5小时)，又可用较低浓度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小时)。方法如下：

 (1)接种鼠L成纤维细胞浓度为5×105CO2/孔/皿生长2～3天，当达50%板底面积可用。

 (2)乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo质粒DNA，空气干燥后溶于40μL的TE中，或取供体DNA。

 (3)用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生长因子血清的DMEM洗板(皿)。

 (4)在80μl热的10g/L DEAE-葡聚糖中缓慢加入DNA，取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)细胞中，使其分布均匀轻轻转动直到显示均匀一致的红色，培养4小时。

 (5)从孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室温放置1分钟，吸出DMSO，用5mL 1×PBS洗一次吸出，加入10mL培养液(10%血清的DMEM)。

 (6)培养细胞，在适当时间分析细胞，若含有抗药基因，可用G418选择培养液培养，方法同前。

 (四)电击法(Electroporation)

 1、原理

 本法需用特殊设置(电穿孔仪)，把悬浮状态的受体细胞和供体DNA共同放入皿中(或杯中)，再施以高压电脉冲，能够促进DNA通过细胞膜而进入胞内，并可整合到细胞的DNA中，使细胞发生转化。如转移的DNA为带有选择标记基因的质粒，也可在选择培养基中进行鉴定。

 2、方法

 (1)DNA制备(同前)

 (2)细胞：离心收获对数生长期细胞5×106。

 (3)漂洗：吸除上清，加4℃PBS冰浴20分钟，离心去上清。

 (4)重悬：于冷4℃PBS中重悬细胞，调成5×106/ml PBS。

 (5)加DNA：加入已被酶切割的DNA 1-10μg（原体积75μl），装入电击小室中，把小室置于电击器中。

 (6)电击准备：接通电源，调至2000V和0.9mA极限，将瓦数和电流标度盘调到5%。

 (7)电击：接通安全开关，使电源横过电击室放电，在无菌条件下，把电击后细胞转入培养瓶中，续加10ml培养液，置37℃CO2培养。

 (8)培养：如含有标记neo基因，可按前述筛选培养法处理。

 注意：上述电击参数仅供参考，与其它方法一样，因细胞转染DNA不同，所需电击条件可能需相应改变，因此为获理想效果，以求得最佳条件。

 (五)细胞显微注射转染法

 本法是借助显微注射器直接把DNA注射入核内，使之发生整合入受体细胞基因组中的技术。本技术需要有严密无菌的净化室，以免敞开操作污染，同时要能有自动拉针仪以制备显微针，一般用手动拉针器拉制时要能使针末端有一个0.6cm长的细部，太长易折断，针尖开口为2～3μm间，针口小于1μm更佳，针尖开口大于5μm易刺伤细胞。具体方法如下：

 (1)注射用DNA制备(同前)。

 (2)显微注射针：取显微注射针数个，镜下挑选最佳者，高压灭菌后，无菌吸入一定量的DNA，把注射针安装在显微针持针器上，调动控制器旋扭，选择注入DNA压力参数。

 (3)细胞：取一皿生长状态良好的细胞，置于显微针台上(能自控调温)，敞开皿盖，调动持针器把显微针移入培养皿内。

 (4)注射准备：调动持针器旋扭，把针尖调至接近细胞(相差镜下观察)使针的长轴与培养皿平面保持30°左右。超过45°注射时，针尖易折断，小于30°时，针的柄部会受培养皿边缘阻挡，靠在皿边上能有助于限制注射针的活动范围。

 (5)注射：选健康完整的细胞(或受精卵)，把注射针尖调至对准细胞质边缘（如接近中央或超过中央，注射时细胞易被针尖穿透），脚踏注射开关，则一定量的DNA即被注射入细胞内，可立见细胞微微膨张。说明DNA已被注入，如此反复注射至所需数量的细胞。

 (6)培养：其培养、观测、筛选等方法与其它转染法相同

 采用此法在大量细胞群中被注射的细胞仅为少数，由于注射损伤，需进行修复，增殖变慢，因此，难以从中克隆出被转染的细胞，因此采用neo基因共转染和G418筛选法是可行的或采用标记刮除法也可。细胞显微注射法除适于注射DNA片断、寡核苷酸外，也可用于注射蛋白质、抗体及各种对细胞有影响的药物。

 三、逆转录病毒载体介导DNA转染

 逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内反转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。

 首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。如：ψ2(第一代包装细胞)，PA317(第二代包装细胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包装细胞)，包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包装细胞可产生RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。

反转录病毒作为基因转移的载体有如下特点：①反转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%；②病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失；③外源基因整合的拷贝数一般只有一个；④反转录病毒只选择感染分裂细胞；⑤病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。

 反转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，包括两侧的LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。

 (一)可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立

 1、逆转录病毒载体进入包装细胞系

 从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系，可从稳定感染细胞中选择病毒产生细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系，从中选择病毒的产生细胞。

 1.1准备工作（用品）：

 (1)适当的包装细胞系及培养液

 (2)大多数包装细胞系为鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可帮助被去除某些功能结构基因的逆转录病毒复制，并包装于蛋白衣壳中。

 (3)逆转录病毒质粒DNA常构建成含有抗药基因neo新霉素基因的载体。

 (4)Hepes-缓冲液(HeBs)

 (5)2mol/L CaCL2

 (6)含血清及不含血清培养液

 (7)HeBs 15%甘油（HeBs/甘油）

 (8)800mg/L(100×聚凝胺)(肝素对抗物)

 (9)10%～15%DMSO

 (10)10cm、6cm培养皿

 (11)24孔、6孔培养板

 (12)克隆环

 1.2操作步骤：

 (1)转染前，10cm培养皿中接种大约10%～20%皿底面积的包装细胞。

 (2)将10μg含抗药基因的逆转录病毒质粒DNA加入0.5mL HeBs中，加入32μL 2mol/L CaCL2,轻振动，加盖30分钟，室温下培养45分钟，直到小的、模糊的兰色沉淀产生。

 (3)从包装细胞中弃去旧液，轻轻滴入HeBs-DNA沉淀于细胞培养皿中心，使细胞接触DNA20分钟，每10分钟轻轻摇动培养皿，使溶液均匀，加入10mL培养液，并于37℃放置4小时。

 (4)完全吸出培养液，逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油，放回培养箱继续培养，如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包装细胞系，需培养3.5分钟，若为Q2bn包装细胞系，需培养1.5分钟，或根据不同包装细胞选用不同时间。迅速弃去HeBs/甘油，用10mL培养液洗2次，加入含有血清的5ml培养液培养18～24小时。

 (5)取出培养液用0.45μm过滤，可获得含有短期产生病毒的培养上清，-70℃或-80℃贮存，或立即用于其它包装细胞系的感染。

 (6)加入10ml培养液于上述已感染的细胞，继续培养2～3天，继续步骤10。

 (7)另一包装细胞受感染前1:10或1:20传代。

 (8)倒去包装细胞的培养液，加入步骤5获得的病毒。方法如下：

 对于10cm培养皿，将0.1至1.0mL病毒贮存液稀释至3～5mL的终体积，加入800mg/L聚凝胺至终浓度为8 mg/L，培养1小时以上。

 (9)若10cm培养皿加入10mL培养液，6mL培养皿中应加入4mL培养液，培养2～3天。

 (10)步骤6或步骤9得到的感染细胞，2～3天后按1:10或1:20传代，接种于选择培养液培养3天，更换培养液，继续培养3～4天，直至克隆出现。

 (11)用克隆环挑出分离的克隆，每个克隆接种24孔板或6孔板中的二个孔，生长至50～90%底部面积。

 (12)倒去培养液，换入1倍体积的培养液，继续培养1～3天，收取培养液，马上滴定，或者贮存于-70℃或-80℃。

 (13)继续传代克隆细胞直到能被冷冻或被鉴定，若病毒产生克隆被鉴定，10%～15%DMSO保护剂液氮冻存细胞。即产生病毒细胞系建立。

 2、病毒滴度鉴定

 在分离产生病毒的克隆后，需进行病毒滴度的测定，常用的方法是用病毒感染目的细胞，可根据载体RNA或蛋白的出现粗略定量分析。

 2.1准备工作：

 (1)病毒贮存液（步骤5所得）

 (2)目的细胞系(NIH3T3成纤维细胞)

 (3)G418或其它选择性药物

 2.2操作步骤：

 (1)目的细胞系NIH3T3细胞在感染前一天按1:10至1:20接种6cm培养皿。

 (2)感染当日，弃去目的细胞培养旧液，加入含病毒的贮存液(步骤5所得)，用1～2ml含0.01～0.1病毒贮存液感染6cm培养皿目的细胞(或者3～5ml用于10cm培养皿中的细胞)，加入800 mg/L聚凝胺至终浓度为8 mg/L，培养1～3小时，37℃。

(3)加入培养液，稀释聚凝胺至2 mg/L，再继续培养2～3个细胞周期(NIH3T3细胞周期为2～3天)。

(4)-a，如果病毒带有组化标记基因，如LacZ,用X-gal染色感染细胞。按步骤6计算蓝色克隆的数量以得到病毒的滴度。

(4)-b，如果病毒携带抗药基因，传代细胞应选择培养条件。如果抗药基因为neo，细胞按1:10至1:20传代，接种含有G418的两个10cm(或6cm)培养皿中，培养3天。

(5)更换培养液(含选择性G418药物)共培养7-10天，此时克隆应该非常明显，计算克隆数。

(6)滴度计算公式：

 G418-RCFU(集落形成单位)/m=克隆数/病毒体积(mL)×复制因子X接种率

 若为(4)-a中所叙，病毒携带LacZ,用X-gal染色细胞根据显示的克隆数，计算病毒的滴度，其公式为：

 X-gal CFU/mL=X-gal阴性克隆数/病毒体积(mL)

 (7)其它方法再鉴定产生病毒的克隆，细胞所产生的病毒基因无重新排列或缺失。

 2.3 X-gal对感染细胞的染色方法（此方法可使该病毒感染细胞着色，可用于直接测量病毒滴度）。

（1）准备工作

 除以上各种实验用品外，尚需：

 ①带有LacZ编码病毒的转染(或感染)的细胞；

 ②固定液：0.05%戊二醛或2%多聚甲醛；

 ③X-gal染液。

（2）操作步骤

 ①倒去培养液，向感染细胞的皿中加入固定液(6cm皿加2mL，10cm皿加5mL)，加2%多聚甲醛室温固定60分钟，或0.05%戊二醛固定5～15分钟。

 ②去除固定液，用PBS洗3次，第二次洗涤时放置10分钟，首次和末次洗涤时则快速。

 ③加入最小体积的X-gal溶液，盖住细胞37℃1小时或过夜，阳性细胞（病毒感染细胞）则成兰色。

 (二)原代培养正常上皮细胞的逆转录病毒转染

 通过将病毒基因转染到上皮细胞中，使细胞可在体外无限生长，保持正常上皮细胞的特点。

 1、准备工作：

 (1)产生病毒的细胞系，方法见上。

 (2)DMEM培养液 谷氨酰胺0.02μg/mL

 胰岛素0.25μg/mL

 转铁蛋白0.12μg/mL

 葡萄糖67.5μg/mL

 10%小牛血清

 聚凝胺1μg/mL

 氢化考的松0.02μg/mL

 (3)丝裂霉素C、胰酶、6cm培养皿

 2、操作步骤：

 (1)病毒产生细胞系暴露于丝裂霉素C(4 mg/L)2小时，洗干净后，胰酶消化，按5×106接种6cm培养皿，培养液为DMEM。

 (2)待转染的原代培养正常上皮细胞接种于铺有以上细胞的培养皿中，培养3天。

 (3)更换培养液，继续培养24小时。

 (4)取50μL培养上清，进行病毒滴度检测，方法同前，9×103～7×104集落形成单位/mL可用于转染。

 (5)正常上皮原代培养10天后，取贴在饲养层细胞的上皮细胞，保留至上皮细胞数生长量足够选择。

 (6)在上皮细胞生长2～4周内，成活的克隆用克隆环挑出，再继续使用三轮有限稀释法建立单个细胞系克隆。

 3、鉴定：

 按病毒所带有的抗药基因进行选择培养筛选，或其它方法鉴定转染细胞，方法见后。

 4、注意事项：

 无论用什么方法将DNA导入细胞，暂时或稳定的转染率很大程度取决于细胞的类型。不同的细胞系对获取外源性DNA以及表达的能力相差几个数量级。此外，一种方法对一种培养细胞有效，但对另一种培养细胞可能无效。

 四、转染细胞鉴定

 在转染之前，外源性DNA载体，可设计含有抗药性基因，再用选择性培养液，筛选转染细胞的方法已介绍，转染后的受体细胞可能仍为正常细胞，但具备了一些其它生长特点，而有的则可能发生转化。

 人肿瘤DNA转入NIH3T3细胞后，细胞排列紊乱，核浆比例增大，可见核分裂相增多。

 人正常上皮细胞经SV40大T病毒转染后，可建立细胞系，细胞呈无限生长，但上皮细胞形态基本不变，光镜、电镜观察可见转染后的上皮细胞与转染前上皮细胞结构相似。下面简述一般的鉴定方法：

1、被转移DNA检测

经转染的细胞提取基因组DNA，以适当限制性内切酶酶切后，进行Sourthern转移分析，检测经转染细胞中是否存在被转移的DNA序列。

若人肿瘤DNA转染鼠NIH3T3细胞系，则可在转化细胞中分析人Alu序列，动物细胞中没有人这种特有的Alu序列，NIH3T3细胞经人肿瘤DNA转染后，应带有人的Alu序列。

若SV40大T病毒突变DNA转染人正常上皮细胞则可在转染细胞找到SV40病毒DNA。

此外，若用质粒DNA转染细胞，可在质粒DNA上设计抗药基因或可检测的标记物基因。这样，所得克隆可针对这些标记物进行鉴定，如neo基因和LacZ基因，鉴定方法同前。

2、免疫组织化学染色

选择一些特异性抗体鉴定特定的细胞，如正常原代培养上皮经转染后，可用结合上皮细胞的抗体或角蛋白来证实转染细胞为上皮细胞，同时也可用波形丝蛋白抗体，上皮细胞应为阴性。

3、软琼脂培养

可用于区别正常细胞和转化细胞。

3.1用品：

0.9%琼脂糖 1.5%琼脂糖

DMEM20黃 5%谷氨酰胺

DMEM12黃

3.2步骤：

(1)将培养液预热至37℃

(2)将1.5%琼脂糖加热煮沸溶熔化灭菌，冷却至40℃，保温。

(3)取1份1.5%琼脂糖，2份培养液 20黃 5%谷氨酰胺混合。

(4)取3mL以上液体，铺6cm培养皿中，并冷却形成胶状。

(5)将0.9%琼脂糖加热煮沸，冷却至40℃。

(6)取1份0.9%琼脂；2份DMEM 12黃，4×105待测细胞(温度不超过40℃)混匀。

(7)取1.5mL以上溶液，加入已预先铺好的琼脂糖的培养皿上。

(8)37℃ CO₂培养。

3.3结果分析：

若是转化细胞，则可见软琼脂中形成克隆，若为正常上皮细胞，则不形成克隆。

4、转染细胞的致瘤性检测

取2×10⁶转染细胞，悬混于0.1mL PBS中，在无菌条件下接种于4周龄雄性裸鼠背部，每种细胞至少接种8个位点，待其生长6个月，若为转染细胞已发生转化，则可在裸鼠身上形成肿瘤。若仍为正常上皮细胞，则无肿瘤形成。以此方法可区分正常细胞与转化细胞。