免疫电镜(Immune electron microscopy)原理

（一） 原理

免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。

该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。

（二）影响免疫电镜的一些因素

1.标记物

用于电镜观察的标记物有三类：一类是电子密度致密的标记物，如铁蛋白、辣根过氧化物酶等。另一类则是放射性同位素，如135I、35S、32P、14C、3H等，第三类则是有独特形状的标记物，如血兰蛋白、噬菌体等。

对标记物的要求是：具有特定的形状、不影响抗原抗体复合物的特性与形状。目前用于免疫电镜的标记物主要是铁蛋白和HRP.两者各有其优点，铁蛋白电子密度致密。观察时反差大，优于酶标记，但铁蛋白分子量大（460 000），穿透能力差，所以适于细胞表面抗原的定位，另外铁蛋白的标记过程比较复杂。HRP分子量小（40 000），穿透力强，有利于标记抗体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位。

2.固定剂

固定是免疫电镜较关键的一步，免疫电镜中的固定与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构，又要考虑到抗原的失活性问题。

（1）固定剂的要求：

①不损害细胞内抗原的活性；

②固定速度快、效果好；

③分子量小，易于渗透；

④固定后，不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。

（2）影响固定的因素有：

①采用固定剂的种类；

②固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差；

③固定剂的pH；

④固定剂的温度，一般采用2℃-4℃冷固定；这样能降低细胞的自浴作用和水分的抽提；

⑤固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致；

⑥与被固定的细胞类型有关。