诺如病毒ELISA检测方法标准操作

一、标本的采集和储存

出现症状后72小时内采样。

粪便量尽量不少于5ml。

贮存于2～8℃，但最多不能超过3天；长期贮存应在－20℃或－70℃。

成形便和肛拭子诊断意义较小。

二、所需材料

IDEIA™ norovirus试剂盒（DakoCytomation公司）

1000µl和200µl微量加样枪及相应不带滤芯的枪头

酶标仪

洗板机

吸水性能好的卫生纸

去离子水(无须高压)或蒸馏水

涡漩震荡器

离心机

50ml管、1.5ml EP管及相应的架子

三、检测前准备

将试剂和待检测标本置于室温（15～30℃）30min。

阴性对照：将1ml样品稀释液（sample diluent）加至标记好的小瓶中作为阴性对照。

阳性对照：1ml阳性对照液（positive control）溶解一瓶阳性对照， 颠倒混匀。未用完的阳性对照可在2～8℃贮存1个月，长期贮存应分装存于-20℃。

每次检测均至少一个阳性对照和一个阴性对照。

空白对照：空气

洗液的配制：1倍体积的洗液浓缩液（WASH BUFFER×25）加24倍体积的去离子水，当天用当天配。

四、标本准备

加入1ml样品稀释液至1.5ml 小离心管中，然后，加入0.1g固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本，置于漩涡震荡器充分混匀，室温静置10min，室温下≥5000rpm离心5min，取上清进行检测或置-20℃冰箱保存备用。

五、检测步骤

1、将需要数量的微孔板置于微孔板架上。

2、每孔加入100µl 10％便悬液以及阴性对照，阳性对照。

3、每孔加入2滴（或100µl）酶结合物（conjugate），用枪头轻柔混匀（上下5次左右），20～30℃静置60±5min。

4、每孔加入350µl洗液（用手轻微摇动1 min左右），弃去洗液，在卫生纸上拍干，共洗5次。

5、每孔加入2滴（或100µl）底物液（Substrate），20～30℃静置30min。待蓝色显现后迅速观察颜色。

6、每孔加入2滴（或100µl）终止液（Stop solution），充分混匀。

7、读取OD450值，打印输出或记录值。结果必须在加入终止液后30min内读取。

六、结果判定

阴性对照：肉眼观察无色或OD450值<0.15。

阳性对照：肉眼观察呈现独特的蓝色或OD450值>0.50。

临界值（cut-off value）：OD450值＝阴性对照OD450值＋0.10。

标本：

a)肉眼观察蓝色比阴性对照颜色深判定为阳性，肉眼观察无色判定为阴性。

b)OD450值大于临界值判定为阳性，小于临界值判定为阴性，OD450值在临界值±0.01

范围内判定为可疑，应重复检测或重新取样。判断阴阳结果按上述方法进行。若OD450值在临界值仍在±0.01范围内，仍判定为可疑，对于可疑样品应用PCR方法来判定最终结果。

七、注意事项

1、便标本处理时震荡时应充分震荡，特别是成形便或稀便，以便于病毒从标本中释放出来。

2、加酶结合物（conjugate）后应用枪头轻柔混匀（上下5次左右），以便于抗原抗体充分结合。

3、读取吸光度应在加完终止液之后30min内完成。

4、所有标本和阳性对照必须被当作具有潜在感染性的物质进行处理。

5、打开后的96微孔板应置于可封口的有干燥剂的口袋中贮存于2～8℃，打开后6周内用完。

6、终止液中含0.46mol/L硫酸，避免接触到皮肤和眼睛。如果终止液接触到这些部位立即用水冲洗。

7、底物液避光保存，不使用已经变蓝的底物液。

8、避免试剂、金属离子、氧化性物质及微生物污染。

9、因标本中可能存在某些腺病毒，该病毒具有与眼结膜结合的能力，在检测过程中应避免手与眼的接触。

10、ELISA板微孔不能反复使用。