超净台里的酒精灯，有害无益？

我所在的实验室有用于培养细胞的超净台，内置酒精灯一个。老师传授授说在打开培养瓶或培养液之前要用酒精灯的火焰快速的烧一下，目的是消毒，减少污染。自己很怀疑这样做的有效程度，因为瞬间的火焰不可能将瓶口的温度升高很多，又如何达到消毒的目的呢？在网上搜索后找到一些资料，认为不应在超净台内使用火焰。现将其放到丁香园上供大家参考，希望有经验的同学给个说法，超净台内到底应不应该有酒精灯。

Open flames are not required in the near microbe-free environment of a biological safety cabinet. On an open bench, flaming the neck of a culture vessel will create an upward air current which prevents microorganisms from falling into the tube or flask. An open flame in a BSC, however, creates turbulence which disrupts the pattern of HEPA-filtered air supplied to the work surface. When deemed absolutely necessary, touch-plate microburners equipped with a pilot light to provide a flame on demand may be used. Internal cabinet air disturbance and heat buildup will be minimized. The burner must be turned off when work is completed. Small electric "furnaces" are available for decontaminating bacteriological loops and needles and are preferable to an open flame inside the BSC. Disposable sterile loops can also be used.

事实上使用酒精灯会造成空气对流，从而带起超净台面上的灰尘，反而增加污染的机会。更何况还增加了火灾的隐患。

The flaming of lips of tubes and flasks must ALWAYS be done whenever culture liquid is to be poured from a container (e.g., pouring plates). Flaming should be routinely done when caps are removed from tubes during transfer of cultures. The purpose of flaming is not to sterilize, but to warm the tube and create warm air convection currents up and away from the opening. This "umbrella" of warm, rising air will help to prevent the entrance of dust particles upon which contaminating bacteria reside.

受到加分的鼓励，把CDC这段生物安全柜的文章翻译了。错误之处，万望指正，谢谢。译文如下：在生物安全柜几乎没有微生物的环境中，明火是不需要的。在开放的操作台上（BSC之外)，通过灼烧培养瓶口，可以创造一个向上的气流，预防携带微生物的尘埃坠落入试管或培养瓶。而在一个生物安全柜中，明火产生扰动气流，破坏了供向操作台面的洁净空气的流向。如果真的确实需要明火，可以使用装备控制火焰大小的微型灯具。这样，柜内空气扰动和加热效应会减少到最低。需要火焰的操作结束后，必须关闭灯具。另外，相对于在生物安全柜内使用明火，更好的选择是使用电气化的“熔炉”来消毒接种环和接种针。一次性的无菌环也是一个选择。

1、快速过火是不可能杀灭细菌的，过火的目的是为了固定住细菌防止扩散，火焰的温度能够使气流形成负压，在酒精灯周围10cm处形成一个无菌区，操作在此范围内进行为好。

2、一些器械，包括镊子，剪刀，接种环，滴管尖端都可以采取火焰灼烤的灭菌方法。但是要烧烤足够长的时间，并且接触组织时要充分冷却。

3、在正常情况下，快速操作比在酒精灯附近磨蹭无菌效率更高。

我认为超净工作台内应该放酒精灯。首先，超净台内的净化空气是从上面往下吹，它的热量可以形成对流，可以在局部形成无菌区预防微生物感染。其次，酒精灯的消毒作用也是不能忽视的：做实验时将培养瓶内的培养液或其它液体倒掉时，瓶口难免会有一些细胞，可以在酒精灯外焰上过几下，产生的高温可以消灭细胞，避免细胞交叉污染；装培养液和各种液体的瓶子口受污染的几率也是很大的，在火焰上消一下毒也能预防污染啊；超净台内的用过的吸管进行消毒也是必要的，因为紫外线不能100%的消灭微生物。再一个，我们老师在加拿大读博士后一直都是这样做的，应该没问题吧！这只是我的个人想法，不一定对！也请高手发表一下意见，大家讨论一下吗！

请问如何“固定住细菌”呢？在不固定的情况下，细菌是如何扩散的呢？

一般来说这种固定可能通过这样两种途径：

1、气流封闭，火焰产生热负压，使外界气流无法进入冷的容器内。

2、火焰的瞬时高温能使灰尘（上面附着细菌）粘附在瓶口处，而不会进入容器内，这有点类似作细菌染色时的烤片。一般瓶口处很容易积留灰尘，在打开盖子的瞬间会导致灰尘飞出。

超净台内的洁净气流是单向流动的，以此来保护操作对象不被超净台外面的空气污染。而酒精灯产生的火焰却干扰了正常的气流，有可能使含有灰尘颗粒的空气掺入超净台内。

我们试验室采用美国势管理，在美国CELL CULTURE是看不到酒精灯的，我们实验室也禁止使用，被发现使用是永远不许进来做试验的。他们这样管理是有他们道理的，实验室到现在为止没有一例细胞培养有污染的。各位也谈论了很多酒精灯的利弊，但归根揭底弊是要远远大于利的，所以应该禁止酒精灯的使用！我相信随着我们国家的实验室条件的增强，酒精灯会绝迹的。转而更强调无菌操作，这才是细胞培养的根本。

我觉得不能单纯的看国外用不用酒精灯，就机械的去学习。因为国外细胞室是很干净的，洁净度很高，尘粒很少，净化台质量又好，有独立的通风系统而且细胞室内是正压，空气是只能从细胞室往外跑，而外面的空气进不来，他们污染的几率很低，用不着使用酒精灯，而国内，我们自问真正符合标准的细胞室有几个，我们的空气里的灰尘也比国外多得多，同意ryochan 的观点，酒精灯还是有很多好处的，总之，还是不要去掉酒精灯得好。

用或不用酒精灯？我们学校两种科研平台都有，一边是美式标准的实验室，禁止使用酒精灯，不用穿隔离衣‘不用带口罩帽子；一边是“正统”的无菌室，酒精灯必备还有进入前穿好隔离衣并戴好口罩帽子，强烈的反差，呵呵不过两边的细胞都养得好好得，所以个人觉得没有必要去争论这个东西，看个人习惯和具体地方情况了，反正都能养好细胞～

我们公司在美国总部的实验室都是用酒精灯的。所以，所谓的美国式实验室不用酒精灯显然是片面的。关于超净台要不要用酒精灯应该具体问题具体分析。比如说，培养的时候需要炙烤，那显然需要酒精灯。如果不需要炙烤，那点酒精灯显然就是多余了。

1、美国的细胞培养实验室一般都设在普通的屋子里，我在美国差不多呆过5、6个实验室，也见过不少其他的实验室，还没有见过细胞培养室单独特殊建造的。相反我发现国内的不少细胞培养室单独按照无尘车间的要求建造。究其原因，可能是因为国内的空气中粉尘比较多，污染的可能大些，所以对培养室的建造上反而下工夫。另外可能是因为国内无尘车间的施工便宜。在无尘车间中培养细胞，毫无疑问会减少污染的机会。但其施工成本，以及维护成本（无尘车间的过滤系统是要定时清洗和更换的，我担心不少的实验室以为造好车间就万事大吉了），还有进出的不便利，是不是值得，有待探讨。

2、就我在国外细胞培养实验室和我们公司的细胞培养实验室工作的经验，细胞培养室不需要一个异常洁净的环境。一般来说，地板如果是光滑容易清洗的（地坪漆、大理石、瓷砖均可），墙面使用不会剥落粉尘的油漆，窗户一般不要打开。这样的房间，只要定期（1-2天）拖地，就足够达到需要的洁净度了，因为真正的洁净环境是在超净台内。

3、回到要不要使用酒精灯的问题。首先在超净台内使用酒精灯的目的显然不应该是产生一个无菌的气相，因为超净台内的气相本来就是无菌的，所以使用酒精灯的目的，就是把有可能在瓶口的细菌杀死。那么只要在瓶口有合适的保护，就不需要了。我们实验室一般使用的培养液瓶在灭菌的时候，都会在盖上包上锡泊纸，使用过程中拿下，用完后又包上。所以我们是不使用酒精灯的。

在我看来，使用酒精仍然是从以前超净台技术比较差，或者是从普通场合中的无菌操作（比如普通实验室中一些分子克隆的操作）延袭而来的。在细胞培养的超净台内并不需要。有人提到美国的实验室中也有人使用酒精灯的，我的观察是在美国实验室中使用酒精灯的人往往是年纪比较大的人，或者一些照搬他们技术的人。

问题的关键在于火焰消毒的方法和原理。细菌培养中使用的接种环或接种针需要使用火焰以加热到很高的温度，在这个温度下金属的接种环/针会变红，估计在1000摄氏度左右。多数实验室是使用本生灯来完成这种火焰消毒的。然而鉴于火焰消毒的不利因素，如干扰层流设备（laminar flow hood，即超净台）中的气流，并可能引起火灾，人们设计了无需火焰的电加热设备，开关在地面通过脚踏控制，消毒完后即可关闭。而在哺乳动物细胞培养中，显然没有像接种环/针那样需要加热到很高温度的情况。多数常规的操作只是将培养瓶口或镊子在火焰上晃动一两下，难以想象这样的消毒能达到足够高的温度以杀灭微生物。并且这种“任何东西都要烧一烧"的简单思想容易造成一些塑料制品的损害，比如一次性培养瓶/皿、移液器等。

最近集中在做细胞转染的试验，养了多种细胞，污染也时有发生，在追究其原因的过程中有幸拜读了此topic，受益非浅，小弟的意见是：

1、 在开启培养瓶、皿等lids时用酒精灯烧一下主要目的肯定不是消毒灭菌，因为一时间不够长，二温度不够高，小弟认为烧一下的目的主要还是使容器口的particls黏附在局部，不至于在细胞操作过程中误入容器内；

2、国外实验室大多不用酒精灯，个人认为国外实验室的整体enviroment要比国内好的多，比如空气中尘粒少，人员走动少，入细胞培养室有固定的工作服，hood的档次和质量也很高，所以基本上可以不用酒精灯；国情不同，做事的方式也应该有所差异，个人意见在国内做试验还是保留酒精灯比较妥当！

过滤的空气是洁净的没错，但我们毕竟还要从超净工作台外向里面搬好多东西，尤其是原代培养，我不知道楼上有没有人做过原代，实验材料动物，实验器具，瓶瓶罐管的，和做饭差不多，如果试验地点环境不好，季节不好，再考虑试验动物本身这样那样的意想不到的毛病（我做海洋生物，相信各位对其脆弱易招病早有耳闻），所以，使不使用酒精灯，这根本就是因人因地因时而宜的事，如果条件够好，细胞没污染，当然可以不用。但如果条件不好，就得应用。真正的标准只有一条：细胞不污染。酒精灯只是过程和手段，不是标准。

高温对细菌具有明显的致死作用，因此最常用于消毒和灭菌。大多数无芽孢细菌经过55～60度30～60min的作用才死亡，含芽孢的细菌，对高热有极强的抵抗力，如炭疽杆菌芽孢，可耐受5～15min煮沸，肉毒梭菌芽孢则需煮沸3～5hours。干热的杀菌作用主要为脱水干燥和使大分子变性，普通细菌80～100度1hour，芽孢需160～170度2h。至少本人在临床做真菌培育试验时，上级医生总是告诫我在做完一个临床标本以后，一定要把接种针烧红才能再次接种下一个标本，以防污染！我想我们在做细胞时，仅仅将瓶口在酒精灯上晃两下，难道就可以确切达到消灭所有细菌的目的？？？老外强调在做细胞时，拿入hood里的所有物品一定要经过75％的ethanol擦洗，（国内真正有几个实验室真正做到此点），至少本人采用此方法以后污染明显降低，做原代也是这样，如果不强调无菌操作的观念，那么细菌污不污染岂不成了撞大运的事了。

我做了两年的单抗了，一直用酒精灯的做的很好的。如果不用可能也不会污染，但由于用惯了不用心里不踏实哈哈。这是我个人意见，还请高手指点。

国外的细胞室洁净度高，有优质的净化台，有独立的通风系统且细胞室内是正压等优点，可以不用酒精灯，而我们达不到这些要求，当然要用了。我们实验室也有两种要求，一种是细胞室配有固定的工作服，鞋子，禁止将外面的东西带入，不用酒精灯。另一种是可以穿自己的工作服自由进入，可以将外面的东西带入，用酒精灯。不过，培养的细胞都很好，主要是个人操作，注意防护，我们就没有带口罩，拿进去的东西要用酒精消毒的。

看了这么多帖子，学到不少新东西。有几个问题：

1、 酒精灯火焰消毒有没有效果？

2、 如果有效，什么样的物品是可以用火焰消毒的，什么样的又不可以。

3、酒精灯火焰消毒有没有大家都接受的操作规程，比如火焰温度的要求，灼烧时间的长短，要求烧到的温度及持续时间。

4、如何检测酒精灯消毒的效果？

我觉得也是啊，我们实验室用酒精灯，也没有看到什么污染啊，国内的实验室怎么敢和国外的比嘛。洁净程度达不到可以使用一些经济节约的办法。比如说小量使用载玻片时就可以在75％酒精里浸泡后在火焰上烤干。简单实用。有些物品上沾上了液体也可以用火烤干。我们的超净台里经常堆一堆东西而且还两个人合用，还不是好好的。实践出真知。其实我觉得酒精灯在我们这个阶段完全实用。等到有一天我们的条件和国外一样了，就可以不用了啊。要用什么也要看我们的国情嘛。比如说买不起分装液体的瓶子可以自己从科里找输液瓶消毒了来用。好用的很，还不用掏钱。可以重复使用。不能像人家外国人一样买一次性的来用啊。

生物安全柜和超净台不是同一事物。超净台出现教早，是为了保护样品免受操作过程污染。其中的气体未经处理直接派出，不能保护工作人员的安全，而生物安全柜是设计用以保护操作者、实验室环境及实验材料避免接触在操作原始培养物、菌毒株及诊断标本等具有传染性的实验材料时可能产生的传染性气溶胶和溅出物。可分三级。是根据一种层流理论和HEPA过滤器的应用整合起来建成的。这一理论是指：达到某一恒定流速的沿一平行线单向流动的空气（如层流）有助于捕捉和排除空气传播污染物。但酒精灯的火焰能形成湍流，从而破坏这种保护性的空气模式。所以不能使用明火，可以用电子“炉”或微燃烧器代替。

生物安全柜里面建议不要使用酒精灯，因为酒精灯的火焰能形成湍流而破坏生物安全柜的垂直气流。细胞培养时，为避免污染需要注意的环节甚多，既或在生物安全柜里面操作也是这样，比如其HEPA膜并非一劳永逸，需要定期检测其除菌过滤效果，必要时用环氧乙烷或甲醛熏蒸或更换。建议在超净工作台和层流间内的台面上操作时最好还是使用酒精灯。

个人觉得：生物安全柜和超净台是两个不同的概念。国内使用的超净台是不能和生物安全柜比的，这么简单的超净台根本做不到无菌的环境（可以说是个开放的空间），所以超净台内用酒精灯还是有必要的。我们实验室在生物安全柜内，没需要不用酒精灯的，在普通的超净台内一定要用酒精灯的，不用的话细胞肯定死翘翘了。大家都是明白人，都不希望用酒精灯，多麻烦呀。可我们又买不起生物安全柜，所以只能将就使用国货（超净台）了，国货＋酒精灯，绝配，符合国情。

除了很多朋友着重强调的国外空气环境好之外，还有一点就是国外超净台的维护和质控有保证。很多大学或科研机构都有专门的技术人员定期（我当时所在大学好像是每三个月一次）检测各个超净台的运转情况，主要指标之一就是用仪器检测单位时间内从超净台内的上方飞落的粒子数，并且上面的滤网定期更换。大家可以看一下自己的超净台，什么时候做过这样的维护？特别是在国内这种空气条件下，滤网没准儿早就堵得查不多了。最近几个帖子的作者都认为中国的超净台不够好，并且跟生物安全柜的原理也不一样，所以里面不够干净，因此需要使用酒精灯的火焰来加热物品，预防污染。（不知总结的到位不）但是，酒精灯的火焰是不是可以用来预防污染，甚至是消毒呢？有效么？有两种可能：1. 有效。因为使用了酒精灯的火焰，我们中国的细胞培养才没有大面积的污染。那么酒精灯火焰需要把物品烧到多少度，多少时间，才能消毒呢？有没有大家都接受并且易于检验的标准呢？2. 无效。类似于安慰剂，只是心理作用。有没有副作用呢？不知道。

细胞培养的过程有时候有些"运气"的成分（如果用科学的术语就是概率），绝对不污染是做不到的，所以我们所作的一切都在于降低污染的概率，不要因为几次操作没有污染就否定某些措施的必要性，我认为酒精灯是否必要的问题我们也可以从这个角度来思考！如果大家还记得我们大学的微生物实验都是在酒精灯的伴随下进行的，为什么呢？酒精灯是最简单有效的消毒措施，酒精灯火焰周围是天然的无菌区，所以在没有无菌室、超净台的时候我们用酒精灯，那么有了无菌室、超净台呢？我们还记得各自实验室的无菌等级吗？10万级？万级？超净台一般100级，这是什么意思？就那100级为例，100级是指1立方米空气中的5微米以上的尘埃数不超过100，也不是完全无菌是吧？前面已经有人指出了快速操作的必要性，原因就在于此。那么酒精灯呢，那种认为酒精灯会干扰气流的说法是没有依据的，超净台的气流是很强，大家在超净台里点酒精灯都会发现火焰是向外飘的，说明气流并没有所干扰，而且火焰也不会把外面的空气吸进去，所以这种担心是没有必要的！而事实上，酒精灯还是有帮助消毒的效果的，表现在：

1、经过酒精灯加热的器皿口会有上升气流，这样从瓶口掉落微生物进入瓶内的概率下降了，有人担心上升气流引起周围空气向瓶口流动带来更多微生物，其实不会如此，这是因为周围的气流不会流经瓶口（瓶口气流上升），所以其中微生物是不会进入瓶内的。开瓶之前先把口烧热，开瓶后污染就少得多。

2、固定或杀死细菌/细胞，有人可能不太理解固定的意思，其实在实验室细菌自己是不会跑的（跑得太慢了），所以细菌的移动不是随着气流，就随着液流，我们适当灼烧瓶口等有液流的地方，使其干燥，就减少了细菌或细胞随液流扩散的可能性，这就是有用的。

3、必要的消毒措施，细胞培养室往往是多功能的，有时要做原代，动物或其内脏要进来，有些手术器械，适当灼烧可以避免污染。有些实验室条件不好，就更是必要了，吸管之类东西如果不是一次性，对高压灭菌又不是很有信心，那么烧一烧是少不了的。那么为什么国外有些实验室不用呢？楼主发的照片其实就能回答了，大家回头浏览一下，他们超净台是不是都有很多东西？当东西太多的时候，酒精灯就是一个危险因素了，容易伤人，失火的可能性也很高。而且具我所知，国外很多实验室实际上也有类似的东西一般是煤气喷灯或者电热灼烧器，可以在方便的时候灼烧。

另外，顺便回答一下什么东西可以烧，什么不可以，烧多久合适等问题：

1、易燃易爆的不要烧（大家有些多余提醒是吧？可我就见过有人把装了酒精的瓶子去烧的）如果有大量的酒精、乙醚、苯等在超净台，就不要点酒精灯了，呵呵，不然习惯。

2、已经接触过溶液的吸管，玻棒，塞子等，不要长时间烧，可以过一下火。

3、烧不要走过场，也不要时间太长，一般以烫手为度（胶塞例外），烧过吸管不要直接吸液体，在瓶口稍微冷却一下就好，不要反复烧。

4、酒精灯灼烧最大的问题在于可能因为高温带来化学污染（产生有毒物质），所以不要对含有机物质的物品长时间灼烧，在尽快完成操作和长时间灼烧之间选择前者。

The flaming of lips of tubes and flasks must ALWAYS be done whenever culture liquid is to be poured from a container (e.g., pouring plates). Flaming should be routinely done when caps are removed from tubes during transfer of cultures. The purpose of flaming is not to sterilize, but to warm the tube and create warm air convection currents up and away from the opening. This "umbrella" of warm, rising air will help to prevent the entrance of dust particles upon which contaminating bacteria reside.摘自：http://structbio.vanderbilt.edu/chazin/wisdom/labpro/sterile.html

每次从试管或者培养瓶中倾倒培养液的时候，都要使用火焰灼烧瓶或者管的盖子。当转移培养物时，也应该常规性的灼烧。灼烧的目的不是消毒，是为了加热试管以产生自瓶口处上升的热对流空气。这种热的空气“保护伞”能够防止携带有污染性质细菌的尘埃落入试管。

上面摘自一篇关于细菌培养中的无菌操作的文章，也是大家很熟悉的东西了，大肠杆菌扩增就是这么搞的。作者说在转移液体或者培养物之前要先用火焰灼烧瓶口，再打开盖子。这样瓶口就会比周围的空气温度高，空气受热形成密度较低的热气流，向上流动，也就是作者说的 “"umbrella" of warm, rising air”。向上的热气流的好处就是，能够预防空气中的尘埃飘落入试管或培养瓶，而细菌是依附在尘埃上面的。空气中微生物大多附着在灰尘粒子上，以微生物气溶胶（Microbiological aerosol）的形式存在于空气中。很显然，原文中的细菌操作并不是在一个洁净空气环境下进行的，而且与超净台内需要垂直、匀速、向下气流截然不同的是，原文需要近乎静止的空气环境，以免干扰微弱的热对流空气。虽超净台内与原文中的环境相差很大，但是使用火焰的操作是相同的。问题在于，两者的目的差别明显，超净台内是为了杀死细菌，消毒；原文是为了产生热气流，防止尘埃落入培养体系。假设原文值得相信（我感觉是有些道理的），那么相同的火焰操作，在两个截然不同的环境下，何以会有截然不同的目的呢？

我们单位对于生物安全柜内的操作是这样的:塑料制品不用酒精灯,玻璃制品开盖关盖都用酒精灯烧口.也没有发生细胞污染现象,我觉得挺科学的，供大家参考。

深有同感，酒精灯使用容易坏，我想应该能起到消毒的效果吧，但不知是不是有其他损害 。

我们现在用的是生物安全柜，用的酒精灯火苗老是朝下走，都炸了好几个了，据他们的工程师讲，安全柜里只能用酒精喷灯，这种灯的火苗是朝上的，一般不会炸裂，比较安全。就是开盖、盖盖用酒精灯烧一下，一直没有污染过。

我个人认为还是放酒精灯比较好，按照传统的做法，我们在开培养瓶和关培养瓶的时候都会过一下酒精灯，这种做法也是安全起见，因为我们在打开培养瓶之后，瓶口是湿润的，如果超净台空气中有悬浮的细菌，它首先接触的就是瓶口，还有，我们在倾去培养液的时候（我一般是直接倒掉，有的同学谨慎点会用移液管吸掉），也有可能会有贱起的液体粘到培养瓶上，过一下酒精灯会一定程度上防止这些情况的污染，在加上高温在瓶口产生的瞬时负压，会阻止空气进入培养瓶，也对防止污染有好处。所以，我认为还是放酒精灯比较好点。

即使国内的空气很脏，即使超净台不如生物安全柜干净，使用酒精灯也不会有任何作用。酒精灯的火焰在短暂的作用于物体表面时，是不可能杀灭细菌的。大家使用酒精灯只是在浪费时间，增加起火机会而已。

生物安全柜和超净台的风向是不同的，前者不需用酒精灯，后者用。

不知道大家有没有做过动态条件下的“超净工作台”、“生物安全柜”的微生物、尘埃粒子的监控？从我们以前的数据来开，其实是怎么搞都可以达到100级的，还可以了。

这里的数据是这样的：作微生物试验的时候用生物安全柜，用酒精灯，结果同步检测4小时，培养皿里面什么都没有长，可以认为没有什么的吧？无菌培养的时候，用超净工作台，用酒精灯，同步检测4小时，结果，培养基里面什么都没有长，也可以说没有什么的吧。也许您要问了，为什么我一定要用酒精灯呢？的确已经养成这样的习惯了，每次打开东东的时候，都用火焰烧烧容器口从个人理解来看，如果大家作培养的，只要用到的东西都是有保证的，应该用不用酒精灯都是可以的吧。

我也认为超净台内可以不用酒精灯，特别是工业酒精，粉尘特别多反而影响超净台内的洁净程度。 还有一个问题就是很容易爆炸，我本人做细胞工作3年左右碰到过两次。

楼上有人说进出超净台物品可能会有污染，我目前都是将进出超净台的物品能用过氧乙酸擦洗的就用过氧乙酸，不能用的就提前放入超净台用紫外先照射30min。