鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法

掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。

2．实验内容或原理

某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。

3．需用的仪器或试剂等

动物 健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。

器材 高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。

药剂

（1）浓缩抗原；

（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；

（3）Alsever细胞保存液；

（4）红细胞悬液；

（5）待检血清

4．实验步骤

(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。

(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。

（3）免疫机体抗体效价的测定：

5 . 鸡新城疫（ND）的HA和HI

（1）试验准备

① 抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。

② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。

红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。

③ 被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内(微量法可用孔径2-3毫米塑料管由翅静脉采血)，在室温中静置或离心，待血清析出后使用。每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。

④ 稀释液：为灭菌的生理盐水。

⑤ 红细胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠(SHOO)0.80克，柠檬酸(2H 2 0)0.055克，氯化钠0.42克，蒸馏水加至100毫升。过滤分装，高压灭菌10分钟，放4℃冰箱保存。

(2)红细胞凝集试验(HA) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。

鸡新城疫病毒的HA试验与HI试验现采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替试管。

① 首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴(0.05毫升)。

② 用微量移液器取病毒抗原0.05毫升，加入第一孔，反复抽动6次后，吸出0.05毫升加入第二孔，在第二孔反复抽动6次后，吸出0.05毫升加入第三孔，如此连续稀释至 第十一孔 后吸出0.05毫升弃去。第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。