酵母细胞的异源功能互补

一、实验目的

　　1．学会外源基因的酵母转化方法

　　2．了解异源功能互补法的原理，学会分析互补的实验结果。

二、酵母细胞的异源功能互补概述

　　利用细菌或酵母突变株克隆基因和研究基因的功能，其原理是具有某种营养缺陷型的突变株在缺少该营养的培养基不能生长，但若将克隆在表达载体上的外源cDNA或表达型cDNA文库转化到该突变株中后，如果外源cDNA能够表达某种与此缺陷型互补的蛋白，即可恢复该突变株的生长，同时也可筛选得到新的cDNA克隆或验证某外源cDNA的功能。

这种方法最初是由Davidson和Niswander提出的，并用于从缺少天冬氨酸转氨甲酰酶的E.coli pyrB突变体中成功筛选到仓鼠的冬氨酸转氨甲酰酶的cDNA。这种原则在获得编码所有细胞看家酶的基因上都得到满意的回答。至今，用E.coli的异源互补法已分离得到的基因有玉米PEP（phosphoenol pyruvate carboxylase）,玉米的GS（glutamine synthetase）,豌豆的GS和豌豆的P5CR （△1-pyrroline-5-carboxylate reductase）以及编码脂肪、碳水化合物、核酸和维生素代谢中相关代谢酶的基因。

　　然而，有些真核细胞的酶需要翻译后加工，是不能应用E.coli异源互补法的。为了解决不能对植物基因进行蛋白翻译后加工修饰的问题，人们发展应用了酵母突变体的异源互补法。尽管用于互补的表达文库一般产生融合多肽，有些酶不能忍受任何N-端的延伸，但该法的筛选效率比抗体或杂交高2-3倍，尤其是对那些非常不容易被纯化或不稳定的蛋白（如膜蛋白等）来说，更是如此。

应用酵母异源互补法用于分离与鉴定的植物基因的例子很多，其中有Fe（Ⅱ）转运蛋白基因IRTⅠ、Fe（Ⅲ）螯合物还原酶基因FRO2，拟南芥菜的NH4-transporter，西红柿中两个铁调控的离子转运蛋白cDNAs（LeIRT1,LeIRT2），玉米YS1（yellow stripel）基因以及大麦SFD1等。另外在研究钾离子通道蛋白方面结合定点诱变、随机诱变等对通道蛋白的结构及功能可作出很好的遗传分析。

三、实验原理

　　缺铁胁迫时，酵母主要通过高亲和系统来转运铁离子，有如下几个步骤：

①转录因子AFT1接受外界信号并启动高亲和系统的大部分基因；

②质膜上三价铁还原酶基因FRE产物还原Fe(III)为Fe(II)，同时可以将Cu 2+ 还原为Cu + ；

③铜转运体CTR1将Cu + 交给铜的分子伴侣ATX1，只有缺铁后ATX1才将Cu + 再交给CCC2；

④CCC2将Cu + 交给多铜氧化酶FET3并在高尔基体内与铁转运体FTR1组装成复合体；⑤由高尔基体将FET3-FTR1分选到质膜上，完成吸收转运铁的功能。当铁吸收的低亲和系统FET4和高亲和系统FET3-FTR的基因被突变后，突变酵母在极限（缺铁）培养基中不能生长，但当外源相应基因转入后的表达可以弥补它的功能，这就是著名的异源功能互补法。