蛋白质的性质实验:蛋白质和氨基酸的呈色反应

1、目的

（1）了解蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

（2）了解某些蛋白质和氨基酸的呈色反应原理。

（3）学习几种常见的鉴定蛋白质和氨基酸的方法

2、原理

蛋白质分子中某些基团与显色剂作用，可生成特定颜色，颜色不同，蛋 白质所含氨基酸不同，但颜色反应不是蛋白质专一反应，非蛋白质物质亦可 产生相同颜色反应，不能用呈色反应来确定是否为蛋白质，但某些颜色反应 可用于蛋白质定量。

（1）双缩脲反应。

在碱性溶液中，双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）与Cu2+结合，生成紫 红色的络合物，这一呈色反应成为双缩脲反应。蛋白质分子中含有两个以上 的肽键，具有类似于双缩脲的结构，因此能发生双缩脲反应。 生成的紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质 的分子质量及氨基酸成分无关。

（2）茚三酮反应。

在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸反应生成 红色）化合物的反应。

（3）黄色反应。

凡含有苯基的化合物均可与浓硝酸作用产生硝基苯衍生物。该化合物在 碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。这个化合物的生成与色氨酸、酪 氨酸有关。绝大多数蛋白质都含有带苯环的氨基酸，因此均有黄色反应。皮 肤、指甲等遇浓硝酸变黄即为这个反应的结果。

（4）坂口反应。

在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下，许多含有胍基的化合物(如胍乙 酸、甲胍、胍基丁胺等)能与α-萘酚发生反应生成红色物质。在20 种氨基酸 中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它呈正反应。

生成的氨被次溴酸钠氧化生成氮。该反应中过量的次溴酸钠是不利的， 因其能进一步缓慢氧化，使产物破裂分解，引起颜色消失。但加入适量尿素 可破坏过量的次溴酸钠。酪氨酸、色氨酸和组氨酸也能降低产生颜色的强度。 甚至会阻止颜色的生成。

该反应灵敏度达1：250 000。因此常用于定量测定精氨酸的含量和定 性鉴定含有精氨酸的蛋白质。

（5）考马斯亮蓝反应。

双缩脲法（Biuret 法）和Folin—酚 试剂 法（Lowry 法）的明显缺点和许 多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976 年由Bradford 建立的考马斯亮兰法（Bradford 法），是根据蛋白质 与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突 出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测 定法。

考马斯亮兰G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大 吸收峰的位置（lmax），由465nm 变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为 兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸） 和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm 下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓 度成正比。

Bradford 法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry 法约高四 倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜 色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白 质浓度的变化比Lowry 法要大的多。