小麦总RNA的提取

互联网2008-06-18

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实验目的

从黄化小麦苗中提取总RNA ，可以为cDNA 文库的构建做好准备。我们重点是要保证RNA 的完整性、产率、防止修饰和纯度，尤其是完整性、防止修饰和纯度。RNA 是单链，2’OH是它的化学性质远比DNA 活泼。所以，提取RNA 颇为不易。

加之RNA 的不均一性，要将所有的RNA （rRNA 、tRNA 、mRNA ）完全提出，更加有挑战性。

而Rnase是无处不在的（这种酶遇高温后也不会丧失活性，复性容易，在胞内外都有分布，不需激活，不需要二价金属离子的配合）； RNA 还最怕DNA 污染，因为若做RT-PCR ，DNA 的存在会降低产物的纯度和效率所有以上的因素都构成了我们成功提取RNA 的障碍。但是我们可以不用考虑RNA 的机械剪切，因为RNA 通常较小，一般不会受到机械剪切的影响。

实验原理及过程

	实验步骤	实验原理
1	所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。	去除RNA 酶（外源）的影响。高温灭菌两次可以破坏RNA 酶的复性过程.虽然RNA 酶极易复性，但两次连续的高温会打乱它的复性历程，从而使RNA 酶失活。 DEPC是RNA 酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA 酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合，从而使RNA 酶失活。因为DEPC能与RNA 的N结合，从而修饰RNA ，所以，必须将DEPC最终除去。在高温灭菌时，DEPC因高温分解而挥发。（UV也能修饰RNA ，实验时应避免。） DEPC灭菌后称为DEPC水，它是不含DEPC的。实验过程中要勤换手套，必要时要在超净工作台中进行。
2	在一灭菌2mL管中加入: 5mol/L异硫氰酸胍 0.7mL 苯酚 0.4mL 2mol/L NaAc(pH4.0) 0.1mL	必须提前准备好变性剂。异硫氰酸胍可以变性RNA 酶，也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以是RNA 酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA 在有机相（酚相）中，而在碱性条件下，DNA 和RNA 都在水相中，无法分离，所以，Ph在本是严重很关键。苯酚用于抽提DNA 和蛋白质。
3	称取0.2g小麦黄化苗的叶片，迅速在液氮中研磨成粉末,转入已准备好的离心管中。剧烈震荡。	低温防止内源性RNA 酶降解RNA 。剧烈震荡是使所有的细胞散开，浸在变性剂中。低温的细胞在相对来说高温的液体中是会形成一团，这样就会使内部的RNA 没有水解RNA 的机会。小麦的黄化苗因为没有光合作用，所以含糖少，易于抽提。
4	混匀,冰浴30min。
5	4℃,12000rpm,10min。
6	上清至另一离心管中加0.4Ml氯仿，剧烈震荡。冰浴放置5min。	去脂类。
7	40C,12000rpm,10min。
8	弃有机相（下层）加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室温放置5min。	去脂类和蛋白质。
9	40C,12000rpm,10min 弃有机相，加入等体积异丙醇。-200C放置1h。	去糖，脱水。因为体系高盐（2mol/L NaAc），所以可以使RNA 沉淀。
10	40C,12000rpm,10min 沉淀用70%乙醇洗两次。	因为提出的量很少，可能不可见，所以离心是要有方向标记。
11	室温稍干燥。	RNA 是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。
12	沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存)	DEPC水中不含RNA 酶。
13	RNA 电泳： 1%琼脂糖胶20 mL 8μL样品 1μL样品缓冲液 1μLSYBR 100V恒压电泳测OD260 和OD260 /OD280