植物基因转化常用方法

一. 植物遗传转化的方法

植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。

二.农杆菌介导的基因转化方法

（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA 的整合机制

几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。

农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA 单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。

1. Ti质粒的结构

在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。

Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA 大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)

T-DNA 上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。

tms由两个成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）

tmr由一个成iptz：

tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物，称为opines。它有三个成员：

octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物

Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物

Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物

据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。

2.T-DNA 的整合机制：

T-DNA 的详细整合机制尚不清楚，但有几个环节是明确的：

T-DNA 切除由Vir区编码的特异性内切酶完成，分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，并形成单链T-DNA 。

T-DNA 的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。

T-DNA 的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列，但整合位点的特异性尚未确定。

（二）Ti质粒转化植物细胞的战略

1. Ti质粒的改造

有以下理由使天然的Ti质粒不能作为表达载体使用：

a. 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。

b. 有机碱的合成与T-DNA 的转化无关，而且可能会影响植物细胞生长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有机碱合成基因（tmt）

c. Ti质粒约为200kb，重组操作非常苦难，也很难找到单一的酶切位点。

d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA 的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。 加入植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物细胞启动子及末端polyA化信号，加入多聚人工接头以利于外源基因的。

植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。

2. 植物细胞转化的共整合系统

T-DNA 在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA 重组分子整合到植物细胞染色体DNA 上，Kmr筛选转化细胞。

3 . 植物细胞转化的双元系统

目前T-DNA 转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA 切割下来，转移到植物细胞中。

（三）改良植物性状的策略

基因技术提供了一种新的改良植物的方法，它可以直接的改变植物的基因型。有两种策略可以应用。

1） 基因附加：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。

2） 基因扣除：利用基因工程技术使一个或多个植物已经存在的基因失活。

灭活植物基因是通过反义技术来实现的。将外源基因反向的连接到载体中，当基因转录成mRNA 后，与正常的mRNA 是反向互补的。我们称这种反向互补为反义RNA ，缩写为asRNA 。

反义RNA 阻止原有基因表达的机理尚不明了，但可以肯定，正义和反义RNA 之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA 很快被核酸酶降解 ，或者反义RNA 阻止了核糖体与正义RNA 的结合。

1 基因附加的方法

我们以抗虫基因为例来说明。

1.1 理想的杀虫剂

在农业生产中危害最严重的是昆虫。为了减少损失，一般使用杀虫剂。大部分杀虫剂没有选择性，杀灭害虫的同时也消灭了天敌，同时对生物圈中的其他生物产生影响，包括人，污染了环境。有一些生物生长在植物体内，可以避免农药的伤害。

理想的杀虫剂具有的特性:

它必须对害虫有害，但毒性应该有选择性，对其他生物无害。

杀虫剂能够必降解，作物收获后不存在残留，并且对环境无污染。

可以保护整个植株，不单单是地上部，免受害虫危害。

到目前为止，我们还未发现这样的理想杀虫剂，最相近的是来自于苏云金杆菌的δ-内毒素。

a) 苏云金杆菌的δ-内毒素

苏云金杆菌在孢子形成的过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白―称为δ-内毒素，其活性很强，有时要比有机磷毒性高80000倍，而且选择性很强，不同品系的细菌和成不同的毒蛋白。

在细菌中积累的δ-内毒素是无活性的前体，昆虫食用后，前毒素被蛋白酶消化后产生有毒性的蛋白，结合到昆虫肠道内，破坏表皮细胞，使昆虫不能进食，从而饥饿而死。不同昆虫中，晶体结构不同产生了特异性。

CryI

鳞翅目幼虫

CryII

鳞翅目和双翅目幼虫

CryIII

鳞翅目

CryIV

双翅目

CryV

线虫纲

CryVI

线虫纲

苏云金杆菌并不是最近才发现的，早在1904年即开始使用，可以作为无公害的杀虫剂，但他很容易降解，所以要不断的补充，增加了农民的成本。因此研究者试图生产不需要连续补充的δ-内毒素，一种方法是利用蛋白质工程，修饰其蛋白结构使其更加稳定，另一种方法是通过基因工程是植物能够合成自己的毒素。

b) 将δ-内毒素到玉米中

传统杀虫剂在玉米上效果较差，主要害虫是玉米螟，生物技术学家试图获得能合成δ-内毒素的玉米。

北卡莱罗纳Ciba-Geigy实验室使用Cry1A(b)内毒素，这是一个1155个氨基酸的蛋白，29-607位的片段具有毒性。Ciba-Geigy研究小组并没有使用完整的基因，只使用了前648个密码子，人工合成了这一片段，这样可以对原始基因进行修饰，使用玉米偏爱的密码子。原始基因中GC含量是38%, 而人工基因的GC含量为65%。

将人工基因连接到盒式载体上，后接一个来自于CaMV的多腺苷酸化信号，利用微粒轰击法将其引入玉米的胚中。胚胎长成植株后，利用PCR法鉴定。利用人工基因特异的片段作为PCR引物。

下一步工作就是利用免疫技术鉴定植株是否合成了δ-内毒素，结果显示人工基因确实具有活性。不同植株中产生的δ-内毒素数量不同，从250-1750ng/mg总蛋白，这种差异是由位置效应引起的。

图11-28 位置效应

转基因植株是否对玉米螟有抗性呢？在田间条差了6个周，应用两条标准来衡量：害虫对植株总的危害，以及虫道的长度。转基因植株表现了较好的抗虫效果，对照虫道长度40.7cm, 植株虫道只有6.3cm。

1.2其它的基因附加工程

在水稻、棉花、马铃薯、番茄和其它作物上也进行了δ-内毒素工程，获得昆虫抗性也不仅仅是指有着一种方法。蛋白酶抑制剂也是较好的选择，它可以一只昆虫肠道内的蛋白酶活性，阻止或减缓害虫生长，许多植物能产生蛋白酶抑制剂，如豇豆和common bean, 他们的基因已经被成功的转移到其他植物中，但一般蛋白的表达量比较低。这种抑制剂对甲虫的效果非常明显，所以对需要长期贮存的种子作物是一种很好的选择。

2、基因扣除

基因扣除这一词语不是很恰当，因为并不去除基因，只是让基因失活。有许多方法可以使基因失活，最成功的是反义技术。我们将以延长货架期的工程番茄为例进行说明。

2.1 反义技术的原理

在一个反义实验中，克隆 的基因是反向的连接到载体中，这意味着当的基因转录成mRNA 后，与正常的mRNA 是反向互补的。我们称这种反向互补为反义RNA ，有时缩写为asRNA 。

一个反义RNA 阻止原有基因合成表达产物，我们尚不清楚其潜在的机理是什么，但可以肯定，正义和反义RNA 之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA 很快被核酸酶降解 ，或者反义RNA 阻止了核糖体与正义RNA 的结合。

2.2 利用反义RNA 延迟番茄果实的成熟

美国的Calgene公司和英国的ICI种子公司利用反义技术改造番茄，延长其货架期。

a)多聚半乳糖醛酸酶在番茄果实成熟过程中的作用

番茄从开花到收获需要大约8周的时间，第6周开始，果实的颜色和风味开始变化，此时成熟过程的基因开始启动，包括多聚半乳糖醛酸酶，使果实开始软化。运输过程中，造成伤害，降低了商品品质。

b)多聚半乳糖醛酸酶基因

在1980s中期，ICI种子公司的生物技术部与Nottinghan大学合作进行了实验。从正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端获得了一个730bp的限制性片断，包含了一半的编码序列，将植物的多腺苷酸化信号连接到片段的头部，CaMV启动子连接到尾部，插入Ti质粒pBIN19中。引入植物后，转录后形成了反义RNA 。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表达。

图11-29 延迟成熟番茄的构建过程

三 病毒介导的遗传转化

植物病毒广泛存在，而且不受单子叶或双子叶的限制。因此病毒作为植物基因工程的载体日益受到人们的重视。在已知300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA 病毒约占91%，双链DNA 病毒、单链DNA 病毒各占3%。RNA 不适合于作为克隆 载体，因为RNA 的操作非常困难。在植物上已知有两种DNA 病毒，花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus, CaMV）和双联体病毒（geminivirus），但都不是基因的理想载体。

花椰菜花叶病毒载体已用来了一个基因进入芜箐甘蓝，有两个因素限制了其应用：

1） 花椰菜花叶病毒的大小，即使是切除了非必须序列，花椰菜花叶病毒载体的承载插入片段的能力还是有限的，只能插入很小的片段。

2） 花椰菜花叶病毒的寄主范围非常窄，主要是芸苔属植物如芜菁、甘蓝和花椰菜等。

二价病毒可能比较有潜力，侵染重要的作物，如玉米和小麦，然而在侵染过程中，二价病毒重新排列并删除部分序列，搅乱插入的DNA 序列。这种病毒可引起破坏性的侵染，需要严格的防护，防止载体从寄主中逃逸侵染自然中的植物。所以花椰菜花叶病毒和二价病毒作为载体还需要进一步的改造。

四 基因枪转化法

农杆菌侵染双子叶植物获得植株是非常成功的，自然界中的农杆菌只侵染双子叶植物，对单子叶植物不敏感。虽然通过添加乙酰丁香酮类物质可使农杆菌侵染单子叶植物，但单子叶植物的再生比较困难，因而农杆菌转化单子叶植物仍然是比较困难的。1984年，科学家发现，超螺旋结构的细菌质粒，虽然不能在植物细胞中复制，但可以重组整合到植物染色体内。受这一现象的启发产生基因直接转移技术。重组机制并不清楚。因为细菌质粒与植物DNA 之间没有同源性。事实上整合是随机的发生在植物染色体的任何位点。

基因枪（particle gun）又称微弹轰击法（microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)。最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。1990年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000系统。基因枪的组成部分有：点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。基因枪转化的基本步骤如下：

DNA 微弹的制备

DNA -微弹载体的制备

靶外植体准备

DNA 微弹轰击

轰击后外植体的培养

基因枪转化率差异很大，一般在10^-3~10^-2之间。McCabe在大豆上高达2%，而有的报道仅有10^-4。相对于农杆菌介导的转化率要低得多，而且基因枪转化成本高；嵌合体比率大遗传稳定性差。即使这样，该方法在单子叶植物上也有广泛应用，有如下优点：

a) 无宿主限制，无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用。

b) 受体类型广泛，原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分省组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击。

c) 可控度高，商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞。

d) 操作简便迅速。

正因为基因枪这些优点，使基因枪成功的应用于：植物基因转化，特别是单子叶植物的转化；外源基因导入植物细胞器；种质转化（茎尖分生组织、配子体、胚胎细胞）。

e) 植物基因表达调控研究。