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细胞培养常用器材与试剂

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4422

器材与试剂

干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等

具体步骤

1. 水:

细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.

2. PBS (也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制):

主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗

溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4•H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。

移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

3. 胰蛋白酶溶液:

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。

用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

4. 0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液

称取胰蛋白酶粉末(1:250) 0.05g,EDTA 0.02g,加入PBSA 100ml,0.22um微孔滤膜过滤除菌,分装,于-20℃保存。

5. 青、链霉素溶液:

所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。 分装于-20℃保存。使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。

6. RPMI1640:

溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。

安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。

使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。

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