分子杂交

对于大的基因组，DNA 酶切图谱凭肉眼是分辨不开的（EB 染色），因为大小不等的分子呈现弥散分布，只有借助灵敏的放射性同位素（或其他化学发光物质），将靶 DNA 在凝胶上（膜上）的带型通过特定的探针与之杂交，转换成 X 光片上直观的带型，才能进行相关分析。

另外如果需要鉴定或寻找与已知 DNA 同源的 DNA 片段如：染色体步查、基因组文库的评价和利用、阳性克隆的分析鉴定、转基因拷贝数分析等也都需进行 DNA 的分子杂交实验。

实验目的：掌握同位素的操作及防护方法；掌握预杂交、探针的标记及分子杂交技术

实验原理：依据碱基配对原则，用放射性同位素标记的 DNA 探针，与固着在膜上的靶 DNA 杂交，经放射自显影，确定靶 DNA 的位置。

1．预杂交：膜上有许多没有结合 DNA 分子的地方，若不在杂交前用一些封闭剂结合位点，加入探针后，探针 DNA 分子将会结合在这些位点上，导致杂交背景深，预杂交的目的是用非特异性 DNA 分子（鲑精 DNA ）及其它高分子化合物（封闭剂）将待杂交膜中的非特异性位点封闭，从而减少杂交背景。

2．探针的标记：体外标记 DNA 或 RNA 的方法有多种，如：末端标记，随机引物标记，缺刻平移（nick translation ），体外转录（in vitro transcription）及各类 PCR 等。

这些方法有的是在特定位置标记核酸（5' 或 3' 末端），有的标记核酸分子内部的多个位点。有的产物是标记单链，有的产物是标记双链。有的方法产生一定长度的标记产物，有的得到的是长短不一的标记产物。

随机引物标记：在 DNA 聚合酶的作用下，寡核苷酸通过与单链的模板配对可以启动 DNA 的合成。如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous ），引物中包含所有可能的随机序列（如 6 碱基引物则有 4 6 =4096 种），可以与任意模板序列相配对在许多位置形成杂交链，四种核苷酸底物中有一种是用同位素标记的，因而可产生均匀一致高比活放射性探针。

同位素标记的探针 DNA 的平均长度与引物的浓度成反比，The klenow fragment 去除了 E.coli DNA polymerase I 的 5 '→ 3 '的外切酶活性，具有 5 '→ 3 '的聚合酶活性及 3 '→ 5 ' 外切酶活性；

Primer：可通过用 DNase I 消化牛胸腺 DNA ，DNA 合成仪合成或直接从公司购买。同位素标记的探针 DNA 的平均长度与引物的浓度成反比 [=k/(lnPc)1/2 ，Pc 是引物的浓度 ] ，一般可产生约 400-600 bp 的标记产物。

模板DNA ：线状双链DNA 。环状 DNA 用限制性内切酶切成线状，再标记。用纯化的 DNA 片段作模板标记的探针与用完整的质粒作模板比较，可减少背景。

dNTPs ： 其中一种用放射性同位素标记

3．杂交：将标记好的探针，加到杂交液中，在一定（温度下）条件下，使探针与膜上的 DNA 杂交。

4．洗膜：用不同组成及离子强度的（严谨度）溶液，洗去膜上的封闭剂及非特异性杂交的探针

实验材料及试剂：已转移上 DNA 的尼龙膜，32P 标记的 dCTP ，随机引物，20 × SSC ，10%SDS ，X- 光片，显影液及定影液等

实验步骤：

1．预杂交：将尼龙膜在 2 × SSC 中浸湿，放入杂交袋或杂交管中，加入适量杂交液（杂交液浸没膜），赶气泡，封口，放入 65 ℃的杂交箱或恒温摇床中，预杂交 3hrs 以上，一般 6-12hrs 。

2．标记探针：

反应体系： 1-2blots(19.5 × 9.5cm 2 )

DNA100ng

dNTP 2.0μl

Random primer5.0μl

Klenow (1u/μl)1μl

α- dCTundefined 1.0μl

add ddH2O to 17.0μl

先将水和 DNA 按反应体系所需的量取至一 1.5 毫升离心管中，混匀，短暂离心至管底，放至 100 ℃干浴中变性 10 min ，变性探针迅速置于冰浴上 5 min ，按反应体系将反应混合液（dNTP ，Random primer ，Klenow ）加入变性 DNA 中，在同位素操作台上，加入32P标记的 dNTP （α- 32P dCTundefined ，放射性比活 >3000℃i/mmol ），30 ℃温育 3hrs 以上。

3．杂交

将标记好的探针，补加 300μl 杂交液，100 ℃变性（or 0.4N NaOH 变性），加入杂交袋（盒）中（忌直接加于膜上）。杂交前作标记效率测定，>25% 以上可以往下做杂交，过夜杂交。杂交效率受杂交速率及杂交稳定性影响。

4．洗膜：从低严谨度到高严谨度冼膜液（具体情况而定）：

1 × SSC/0.1%SDS 洗膜两次（冷 5min ，热 65 ℃，15min ）→检测信号强度→

0.5 × SSC/0.1%SDS 热冼 65℃，15min→依情况可有改动 0.2 × SSC/0.1%SDS or 0.1 × SSC/0.1%SDS 。

5．包膜：膜从洗膜液中捞出，在滤纸上晾干，膜表面无可见水膜为止（注意：不能太干，以防探针难以洗脱影响再次使用），用保鲜膜包膜，压 X^- 光片，置于 -20 或 -70 ℃ 3 — 7 天（依据信号强弱掌握曝光时间）

6．冲洗 X^- 光片

在暗室红灯下取出 X^- 光片，置入显影液中至杂交带显现出来（显影时间依据信号强弱及曝光时间长短可由几秒钟到 2min），转入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮（约 10min）。自来水冲洗干净后，晾干，读片。

7．膜上探针洗脱

再次使用膜前，必须洗去上次探针！

(1)0.1%SDS ，0.1 × SSC 10min

(2)0.1NaOH ，0.2%SDS 2-3min

(3)0.2M Tris.HCl ，0.2%SDS ，0.1 × SSC 20min

只洗去探针，而不影响膜上的靶 DNA （因为 DNA 与膜是共价键结合，而 DNA 与探针的结合是氢键结合）。

附注：

1．杂交效率的影响因素

a.杂交温度：双链 DNA 分子，T=Tm -20—25℃可达最大杂交率，DNA-RNA 杂交分子则低于 Tm 值 10-15 ℃。

b.离子强度 (1.5M/L NaCl 杂交率最高 )

c.双链长度 (形成杂交物长度 )：杂交率与双链长度成正比

d.探针的复杂程度 (重复性探针可以增加杂交率 )

e.pH5.0-9.0 基本无影响。

2．影响杂交稳定性（影响解链温度的）因素

a.离子强度在 0.01-0.4M NaCl 之间，每↑10 ×单价阳离子，Tm^- 16.6 ℃

b.碱基组成 AT c.去稳定剂（destabilizer ）DNA-DNA 杂交分子，每 1%formamide，Tm↓0.6 ℃； 6M urea 可降低 Tm 30 ℃

d.碱基错配：每 1% 的错配可使 Tm 降低 1℃

e.双链长度（探针杂交物）>500bp 基本无影响

3．整个实验过程中应注意的事项

①保证转膜质量；

②操作规范；

③提高杂交灵敏度（信号强度）；

a.探针量及标记量（探针变性）；

b.比活（性）度 >=108dpm/u(<108弱 )；

c.靶 DNA 量（绝对量，酶切转膜决定；相对量，靶 DNA 相对于探针过量时，完全配对杂交，探针过剩时，完全配对和非严格的完全配对均有发生）；

d.有惰性聚合物增加灵敏度； 10%(w/v)500,000(mw)dextran sulfate 或 8%(w/v)PEG6000 。对于单链探针，可以增加 10-fold 杂交信号，dsDNA 成 100-fold 地增加杂交信号

④提高特异性

a.高盐溶液促进探针与靶序列的碱基配对 20 × SSC 3M NaCl/0.3M Na3℃i

b.杂交后洗膜温度 T→Tm

c.杂交后洗膜液浓度组成，高严谨度洗膜液使不完全配对的杂交失去稳定，致使探针脱落

d.杂交时间 8hrs 以后，DNA 探针逐渐退火，少量自由与靶 DNA 杂交 .

e.探针长度（>1000bp）过长，高严谨度下难洗脱非完全配对杂交探针。

4．放射性同位素

①放射性同位素发出的射线主要有

α粒子：外照射，一般能量的α粒子穿透能力较弱，射程短，危害性小，稍加防护即可（如手套）；内照射，电离密度大，危害大。

β粒子：穿透能力比α粒子强，外照射危害比α粒子大，可引起皮肤的放射损伤。

γ射线：穿透能力很强，外照射时危害性很大，应采取切实有效的防护措施。

②放射性活度及单位

放射性活度 A 是指一定量的放射性核素在时间间隔 dt 内发生自发核衰变数 dN 与此时间间隔的比值。即 A=dN/dt

放射性活度的单位是 Becquerel(贝克勒而 )，简称 Bq 。

1Bq=1 个衰变 / 秒； 1 居里 =3.7 × 1010Bq

其不表示放射出射线的多少（如 60℃一个原子衰变防出 1 个β粒子和一个γ光子，而一个 ³²P 原子只衰变出一个β粒子），也不表示射线能量的大小。

③辐射防护的目的

防止发生对健康有害的确定性效应 (接受放射性治疗的患者除外)，并将随机性损害效应的发生降低到被认为可以接受的水平，从而保障放射工作人员、公众及其后代的健康与安全，提高放射防护措施的效益，促进放射工作的发展。

④放射防护的原则

a.辐射实践的正当化：生产必须，医疗必须，科研教学必须

b.辐射防护的最优化：即综合考虑社会、经济等诸因素之后，使个人剂量的大小、受照人数的多少和不确定发生的照射事件的发生概率可合理达到的低水平。

c.个人剂量限制：为了保证每个人不致受到不合理的危害，必须制定一个个人剂量限制值，放射工作人员的剂量限制：全身均匀照射的年当量剂量限值 H全身=50mSv ; 不均匀照射时，有效剂量 E 不应超过 H全身。

⑤外照射的防护措施

a.距离防护：人体受到照射的剂量率随着离开电离辐射源的距离的增大而减少。剂量率与距离的平方成反比。

b.时间防护：在剂量率不变时，剂量与时间成正比，即操作时间越短，人员所受到的照射剂量越小。（要求放射性作业应操作熟练、操作步骤应尽量简单易行，尽量减少在辐射场所逗留的时间。）

c.屏蔽防护：利用射线通过物质时，与物质相互作用使其能量被物质吸收而逐渐减弱的原理，可以设置一定的屏障物来进行防护。常用的材料有水、砖、大理石、混凝土、重金属铅等。

d.利用衰变：可利用放射性物质存在自发衰变，其活性随之减少的原理进行外照射防护。如：半衰期小于15 天的放射性废物，允许放置 10 个半衰期后作一般废物处理。

⑥内照射的防护措施

a.防止放射性物质经呼吸道吸入

b.防止放射性物质食入

c.防止放射性物质经体表进入