蛋白酶K消化裂解法提取制备模板核酸

蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等.

1.试剂配制

　　①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)

　　10mmol/LEDTA
　　150mmol/LNaCL
　　0.5%SDS
　　100～200ug/ml蛋白酶K.

　　②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中.

2.提取方法

　　有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等.

　　临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时， 或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一 次，上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液.

加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR扩增，或放-20℃保存.

　　蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理 后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增. 如杂质较多，还可经酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除 彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.