ATP的生物合成

一、目的

1.了解ATP生物合成的意义。

2.掌握无机磷的测定方法。

3.掌握DEAE-纤维素薄板层析法测ATP的形成。

二、原理

在适当条件下，酿酒酵母分解发酵液中的葡萄糖，释出能量，同时还利用无机磷，使AMP转变成ATP，一部分能量即贮存于ATP分子中。因此，在发酵过程中，可测得发酵液中的无机磷含量降低和ATP含量的上升。

三、实验器材

1.酿酒酵母，新鲜酿酒酵母悬浮于蒸馏水中，离心，弃去上清液。如此用蒸馏水洗涤酵母数次，最后将洗净的酵母沉淀冷冻保存①。

2. AMP、 ATP标样

3.烧杯50 或100ml (1)。

4.电子分析天平。

5.水浴锅。

6.离心机4000rpm

7.722型（或7220型）分光光度计。

四、实验试剂

1.2%三氯醋酸溶液：2g三氯醋酸，溶于100 ml蒸馏水。

2.过氯酸溶液：0.8 ml过氯酸，加蒸馏水8.4 ml

3.阿米酚试剂：称取阿米酚[amidol,二氢氯化-2，4-二氨基苯酚，分子式： （NH4）2C6H3OH・2HCl]2g，与亚硫酸氢钠（NaHSO3）40g共同研磨，加蒸馏水200ml，过滤贮棕色瓶内备用。

4.钼酸铵溶液：20.8g(NH4)6Mo7O24%26#8226;4H2O，溶于蒸馏水并稀释至200ml.

5.1mol/L KOH溶液。

6.1mol/L HCl溶液。

7.ATP溶液：称取ATP晶体（或粉末）50mg，溶于5.0ml蒸馏水，临用时配制。

8.DEAE-纤维素薄板：参看辅助试验。

9.1mol/L NaOH溶液。

10.0.05mol/L pH3.5柠檬酸钠缓冲液：见辅助试验。

五、操作

1.发酵

将0.1g KH2PO4及0.58g K2HPO4溶于3ml蒸馏水。

另将0.1g AMP溶于1ml蒸馏水，倾入上述磷酸钾溶液内，加热至37℃。酵母液5ml，再加4ml蒸馏水稀释，加热至37℃，倒入上述溶液中，再加MgCl2 0.016g及葡萄糖0.5g，再加蒸馏水3ml，混匀，立即取样0.2ml，检测AMP及无机磷的含量。

此时测得的磷称为初磷。薄板层析图谱上只有AMP斑点，无ATP斑点。以后每隔30min取样测定，至明显看出无机磷及AMP含量下降、ATP含量上升即可（约2h～3h）。

2发酵液样品处理

将所取之0.2ml样液置离心管中，立即加入2%三氯醋酸溶液1ml，摇匀，离心（3000r/min）10min。上清液用以测无机磷及ATP含量。

3.无机磷测定

吸取上清液0.3ml置于干试管内加过氯酸溶液8.2ml、阿米酚试剂①0.8ml、钼酸铵溶液0.4ml，混匀，10min后比色测定A650nm。

本实验无需求出无机磷的绝对量，故不作标准曲线。A650nm数值下降即表示无机磷下降。一般情况下，当A650nm下降至比初磷A650nm小0.2单位时，发酵液中既有较多的ATP。

4.DEAE-纤维素薄板层析法测ATP的形成：方法见辅助试验，同时用ATP溶液作对照。

最好放在低温冰箱冷冻结冰。经深冻得酵母，发酵效果好。

阿米酚试剂为还原剂。如用抗坏血酸，效果不好。

辅助试验

一、目的

掌握DEAE―纤维素薄板层析法测定核苷酸的原理和方法。

二、原理

二乙氨基乙基纤维素，简称DEAE―纤维素，结构式如下：

带负电荷的核苷酸离子就被交换上去。控制溶液的pH，使各种核苷酸所带净电荷不同，与DEAE―纤维素的亲和力也就不同，从而达到分离的目的。

三、实验器材

1. 玻璃片4×15cm（×4）。

2. 尼龙布。

3. pH试纸（pH1～14）。

4. 电动搅拌器。

5. 水平板。

6. 水平仪。

7. 铅笔。

8. 紫外分析仪（254nm）。

9. 电吹风。

10. 烧杯1 000ml(×1)。

11. 吸滤瓶1 000ml(×1)。

12. 布氏漏斗%26oslash;20cm(×1)。

13. 微量点样管10%26micro;l(×1)。

四、实验试剂

1. 核苷酸样品。

2. DEAE―纤维素（层析用）。

3. 1mol/L NaOH溶液。

4. 1mol/L HCl溶液。

5. 0.05 mol/L柠檬―柠檬钠缓冲液（pH3.5）：称取柠檬酸12.20g,柠檬酸钠6.70g，溶于蒸馏水，稀释至2 000ml。

五、 操作

1.DEAE―纤维素的处理

先用水洗，抽干后用4倍体积1mol/L NaOH溶液浸泡4h（或搅拌2h），抽干，蒸馏水洗至中性，再用4倍体积1mol/L HCl浸泡2h（或搅拌1h）抽干蒸馏水洗至pH4备用。

2.铺板：将处理过的DEAE―纤维素放在烧杯里，加水调成稀糊状，搅匀后立即倒在干净玻璃板上,涂成均匀的薄层，放在水平板上，自然干燥或60℃烘干，备用。

3.点样：在已烘干的薄板一端2cm处用铅笔轻划一基线，用微量点样管取样液10%26micro;l②，点在基线上，用冷风吹干。

4.展层：在烧杯内置pH3.5柠檬酸钠冲液（液体厚度约1cm）,把点过样的薄板倾斜插入此烧杯内（点样端在下），溶剂由下而上流动，当溶剂前沿到达距离玻板上端约1cm处（10min左右）取出薄板，用热风吹干，用260nm紫外线照射DEAE―纤维素层观看斑点。DEAE―纤维素经处理可反复使用。此法具有快速、灵敏的特点

① 如长期不用，需于60℃以下烘干保存。

② 可用腺三磷粗品或药用腺三磷结晶作样品，样液核苷酸浓度为每毫升5mg左右时，点样量为5～10%26micro;l。可按此标准控制点样量。