血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳

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【 实验目的】

1.进一步掌握电泳的基本原理及凝胶电泳 的原理。

2.熟悉琼脂 糖凝胶电泳的特点和操作要点。

3.掌握正常人血浆脂蛋白的分类。

【 实验原理】

琼脂 糖凝胶电泳的原理：琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3，6脱水L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多糖。电泳时，因为凝胶中含水量大（98%～99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。

血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。因此，以琼脂 糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。

琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离。

通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。此法应用于高脂蛋白血症的分型，可将血清脂蛋白分为几种不同的类型，为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病、高血压以及心肌梗死的临床诊断提供生化指标。

【 器材和试剂】

1.器材 电泳仪、电泳槽、离心机、水浴锅、染色盘、 微量注射器、滤纸、镊子及剪刀、<chmetcnv>2cm/>´<chmetcnv>8cm/>玻璃片</chmetcnv></chmetcnv>

2.试剂

(1)巴比妥缓冲液(pH8.6):称取巴比妥钠<chmetcnv>15.4g/>、巴比妥<chmetcnv>2.76g/>及EDTA<chmetcnv>0.29g/>，加水溶解后，再加蒸馏水定溶至1 000ml（pH为8.6，离子强度0.075），作为电极缓冲液。</chmetcnv></chmetcnv></chmetcnv>

(2)苏丹黑染色液:将苏丹黑<chmetcnv>0.5g/>溶于无水乙醇5ml中至饱和。</chmetcnv>

(3)凝胶缓冲液:称取三羟甲基甲烷(Tris)<chmetcnv>1.212g/>,EDTA<chmetcnv>0.29g/>及NaCl<chmetcnv>5.85g/>,用蒸馏水溶解后，稀释至1 000ml，调pH至8.6。</chmetcnv></chmetcnv></chmetcnv>

(4)琼脂糖凝胶:称取琼脂糖<chmetcnv>0.50g/>溶于50ml凝胶缓冲液中，再加水50ml，在水浴中加热至沸，待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。</chmetcnv>

(5)新鲜血清(无溶血现象)。

【 操作步骤】

1．预染血清 血清0.2ml加苏丹黑染色液0.02ml于试管中，混和后置<chmetcnv>37℃/>水浴染色30min，然后离心(2 000r／min)约5min。</chmetcnv>

2．制备琼脂糖凝胶板 已配制的0.5％琼脂糖凝胶于沸水浴(或微波炉)中加热融化，用10ml吸管吸取约3ml凝胶溶液浇注在载玻片上，静置约半小时后凝固(天热时需延长，可放冰箱数分钟加速凝固)。

3. 点加预染血清 在已凝固的琼脂糖凝胶板距一端的<chmetcnv>2cm/>处，用自制打孔器(在小玻璃片的两面固定两片小胶片)垂直打入凝胶后立即取出，然后用胶片剥出长方小条凝胶。用小片滤纸吸干小槽中的水分，注意不要损坏槽边缘的凝胶。最后，再用微量注射器吸取经过预染的血清约<chmetcnv>20m/>l注入凝胶板上的小槽内。</chmetcnv></chmetcnv>

4.电泳 将加过血清的凝胶板平行放于电泳槽中，样品放于负极一端。用两层滤纸或纱布于巴比妥缓冲液浸湿，然后轻轻紧密贴在凝胶板两端,纱布的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中,接通电源，电压为100～120V，每片电流为3～4mA，约经电泳40～60min，可见分离脂蛋白色带。

【 注意事项】

1.预染血清与温度有关，低温着色慢，高温着色快，<chmetcnv>37℃/>较为适宜。</chmetcnv>

2.浇注琼脂糖凝胶板要尽量使厚薄均一，否则会影响脂蛋白的分离效果。

3.将凝胶板放入电泳槽中，应切记与电力线平行、样品端置负极、搭桥滤纸不能搭在样品上。

【 思考题】

1.琼脂糖凝胶电泳有哪些操作要点？

2.为什么正常人血清脂蛋白电泳时见不到乳糜微粒区带？

3.琼脂糖凝胶电泳有哪些注意事项？