氯化三苯基四氮唑法测定根系活力

一、原理

氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化还原电位为80mV的氧化还原物质，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲 （TTF），如下式：

生成的TTF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。

二、仪器与用具

分光光度计；分析天平（感量0.1mg）；恒温箱1台；研钵1套；100ml三角瓶；漏斗；移液管10ml 1支、2ml 1支、0.5ml 1支；20ml刻度试管；10ml容量瓶；小培养皿；试管架，药匙；石英砂适量。

三、试剂

1. 乙酸乙酯：连二亚硫酸钠（Na2S2O4，为强还原剂，俗称保险粉）；

2. 1%TTC溶液：准确称取TTC 1.0g，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml；

3. 0.4%TTC溶液：准确称取TTC 0.4g，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml；

4. 磷酸缓冲液（1/15mol/L，pH7.0）；

5. 1mol/L硫酸：用量筒量取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml；

6. 0.4mol/L琥珀酸钠：称取琥珀酸钠（含6个结晶水）10.81g，溶于蒸馏水中，定容至100ml。

四、方法

1. 定性测定

（1）配置反应液 把1%TTC溶液，0.4moL/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。

（2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除，将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。

2. 定量测定

（1）TTC标准曲线的制作

吸取0.25ml 0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定光密度，绘制标准曲线。

（2）称取根样品0.5g，放入小培养皿（空白试验先加硫酸再加入根样品，其他操作相同），加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗处保温1h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。

（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出四氮唑还原量。

（4）计算

将所得数据带入下式，求出四氮唑还强度。