磁性微球在生物学和医学的应用

一、免疫磁性微球在自身骨髓移植中的应用

在过去10多年中，高剂量化疗后给予自身骨髓移植（ABMT）已经成为某些患有急性白血病、何杰金氏淋巴瘤（NHL）、神经母细胞瘤及wilms肿瘤的可选疗法。最近，ABMT用于小细胞肺癌、睾丸癌和乳腺癌也取得了饿令人鼓舞的结果。

但是，ABMT也有限制条件，那就是肿瘤转移细胞有可能累及骨髓。因此，在体外清除骨髓中的癌细胞是保证ABMT成功的必要条件。体外净化骨髓已发展起来多种方法。其中，运用免疫磁性微球物理地清除癌细胞的方法具有安全、效果好、操作简单的特点，得到广泛应用。

免疫磁性微球技术发展起来的原因之一，就是越来越多的证据表明，肿瘤细胞亚类可以排斥补体介导的细胞溶解反应。而IMMS净化骨髓不需要特异的ISOTYPE抗体，也不受正常骨髓中抗补体因子的影响，可以清除低水平抗原表达的肿瘤细胞。

自免疫磁性微球问世以来，至今已经应用于几乎所有的需要进行骨髓净化的癌症类型。如神经母细胞、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、小细胞癌、乳腺癌等。

1、用于清除神经母细胞瘤细胞

IMMS最早应用于神经母细胞瘤细胞的清除。1984年，Treleaven等人建立了运用IMMS从骨髓中清除癌细胞的模型系统。清除过程为：将磁性微球与IgG1族的6个单克隆抗体（UJ13A、UJ223.8、UJ127.11、UJ181.4、Thy-1和H11）在4℃、转动状态培养2h后，混合物放在传送装置上通过一系列的磁场。

则神经母细胞瘤细胞被滞留，“干净”的骨髓自然流下。结果表明，在有核骨髓细胞中混有1%的神经母细胞瘤细胞（cell line CHP100）时，用IMMS可清除99.9%的肿瘤细胞。而对正常细胞的损害极小，通过分离装置后，细胞的活性超过了98%。聚落分析证明，BFU-E、CFU-C、CFU-GEM和CFU-E均无显著降低。

2、用于清除淋巴瘤细胞

De Rosa等人将IMMS应用于2例淋巴瘤病人的自身骨髓移植。首先，将骨髓与4种单克隆抗体（CD10、CD19、CD20、CD22）一起培养，再与包有二抗的磁性微球一起培养，最后通过分离装置。微球与靶细胞比例为50：1。

清除后，单核细胞的恢复率分别为56%和40%，CFU-GM恢复率分别为45%和38%。两例病人移植顺利并无并发症。1例4个月后复发，另1例在5个月后依然处于缓解期。实验证明，应用免疫磁性微球在自身骨髓移植前清除癌细胞是一种安全、简单、可重复的技术。

Combaret等人建立了应用免疫磁性微球净化感染了Bmrkitt淋巴瘤或神经母细胞瘤的骨髓移植的模型系统。能够可重现地清除3～4个对数级的恶性细胞，此结果与应用Burkitt淋巴瘤的补体溶解方法所得类似。

对123例患神经母细胞的儿童病人在自身骨髓移植时应用免疫磁性微球进行骨髓净化，结果表明：该过程会导致单核细胞的显著损失，但对骨髓造血细胞五毒。

病人表现出严重的T细胞缺陷，在移植后一年内不能检测出IL2的分泌，但NK细胞的功能在移植后一个月正常，在第二和第三个月甚至超出一般水平，在20例病人中，应用联合免疫荧光法证明自身骨髓移植包含有能够被免疫磁性微球清除的恶性细胞。

Ogniben等人对IMMS在NHL病人自身骨髓移植中的应用也做了研究。

3、用于清除白血病细胞

KorbingLI等人收集了2例复发的急性淋巴细胞白血病（ALL）患者的骨髓，手机时间为二次缓解期的早期。免疫磁性处理过程为姿势呢骨髓与连接在磁性微球上的一组单抗一起培养。移植前治疗方案为全身照射（TBI）（14.4Gy）和环磷酰胺（CY）（50mg/kg，每周2次，共4周）。

自身骨髓移植后，在3例病人中都能观测到血相重建。三人在术后的无病存活期分别为26个月、24个月、27个月。其中两人的无病存活期超过了先前的缓解期（20个月和12个月）。

De Rore等人报告了65例急性白血病或NHL患者的ABMT结果。其中11例应用IMMS进行骨髓净化，31例用Maphosphamide进行骨髓净化，14例没有进行骨髓净化。免疫磁性清除过程包括一次与三种单抗（CD10、CD19、CD22）的培养，两次与磁性微球的培养。

单核细胞与CFU-GH在免疫磁性净化后的恢复率分别为40%和45%，在Maphosphamide净化后恢复率分别为84%和5%。除过Maphosphamide净化后血小板的恢复率较慢小，白细胞、中性白细胞及血小板在三组病人中的恢复速度均类似。

Gruhn、Trickettti等人对IMMS在急性淋巴细胞性白血病中的应用进行了探讨。

4、在其他肿瘤的骨髓净化中的应用

Ball、Myklebust等人将IMMS应用于小细胞肺癌病人的自身骨髓移植。Shpall、Anderson等人将IMMS应用于乳腺癌病人的自身骨髓移植，对应用IMMS清除乳腺癌的最优条件进行了探讨。

5、IMMS与其他骨髓净化方法的联合使用

有多项研究表明，联合应用免疫磁性微球与化学分离法会比单一应用任何一种技术更能有效地从骨髓中清除掉癌细胞，当然，这对骨髓早血细胞的损伤也较大。

Anderson等人联合应用免疫磁性微球和化学分离法从正常骨髓中清除CAMA-1乳腺癌细胞。结果表明，免疫磁性分离后运用40μg/M1的4-HC清除残余的癌细胞可获得4.5个对数级的癌细胞清除率。

免疫磁性微球用于骨髓中癌细胞的清除也有一些缺点，主要是在方法学、靶细胞种类、检测方法的灵敏度等方面变异性较大，但仍不失为一种安全、简便、有效的方法。

二、免疫磁性微球在其他方面的应用

自身骨髓移植时清除其中的癌细胞只是免疫磁性微球的一个应用，它在医药学中的应用非常广泛，如分离其他核细胞、分离细胞器、在微生物和分子生物学上的应用等等。

1、分离其他真核细胞

（1）异体骨髓移植清除T细胞

自身骨髓移植为防止移植物抗宿主反应（GVHD），需要从骨髓中有效地清除T细胞。Vartdal等对直接T细胞清除法做了改进，磁珠首先与羊抗鼠IgG相连，然后再与抗CD2和CD3的单抗体结合。用此方法清除了3个数量级的T细胞。

Frame，Gee和Knobloch[42]等人也报告了相似的结果。Champlin等用免疫磁珠在异体骨髓移植前只清除其中的CD8+细胞，结果发现即可以防止GVHD，又保留了移植物抗白血病的能力。应用免疫磁性微球分离T细胞的还有A1eixo等人。

（2）阳性分离干细胞

直接移植骨髓干细胞是克服异体骨髓移植时GVHD和ABMT时癌症复发的一种可能的选择，但最大的困难是如何分离出纯的造血干细胞。Cottler-Fox等采用反相分离技术，即用连有二抗的免疫磁珠和抗CD3、CD4、CD14、CD16的单克隆抗体清除掉所有非干细胞。

可以获得不到2%的细胞，但其中保留了所有原先存在的造血干细胞。正相分离干细胞的方法也受到重视。

如Smeland等采用直接联有抗CD34+细胞的单克隆抗体的免疫磁珠来分离干细胞，分离后用抗Fab段血清将磁性从细胞上洗脱下来，用此方法可以获得40%～70%的CD34+细胞，纯度可达95%以上。应用免疫磁性微球分离造血干细胞的文献非常多，如

Law，Silvestri，Nakamura，Bigas等等。

（3）组织分型

器官移植中的HLA-1和HLA-2组织分型一般采用数量细胞毒实验，首先要采用密度离心法将细胞从外周血中分离出来，步骤烦琐费时。Vardal等发展了基于免疫磁珠技术的HLA分型方法，结果表明，磁珠不影响后续的微量细胞毒分析。

Lie等发现用此方法也可进行血清的BoLA分型，并且明显优于传统方法。Hanen and Hannestad更发展了应用免疫磁珠的直接分型方法。在磁珠上连接抗人多态型HLA决定族，通过评价细胞和磁珠之间形成花环的程度来直接进行分型。

（4）分离其他细胞

免疫磁珠在从血液中分离、定量、分型各细胞亚类方面的应用与日聚增。Brinchmann等设计了一种快速、直接从血中定量各个淋巴细胞亚类绝对数目的方法。用免疫磁珠分离CD2+ ，CD4+ ，CD8+ ，CD9+后用血球计数板测定形成花环的比例。

Brinchmann同时应用免疫磁珠成功地从自然感染的CD4+细胞中分离出了人类免疫缺陷病毒（HIV），并发现活化的CD8+细胞对自然感染的CD4+细胞中的HIV复制抑制因子。

Egeland等用连有免疫复合物的免疫磁珠从外周血中分离产生类风湿因子的B淋巴细胞。获得了104～106倍富集的特异性B细胞。分离后，B细胞直接用Epstein-Barr病毒转化，大量扩增，随后检测抗体的产生情况。这项技术可以用来生产单克隆抗体。

从单一的抗原特异B淋巴细胞群开始可以增加克隆成功的机会并提高杂交后相关杂合体的几率。Ossendorp等用连有Thyroglobulin的免疫磁珠来与B细胞杂交瘤系形成花环，Throglobulin特异细胞浓集了300倍。其他的应用还包括分离滋养层细胞、嗜酸性细胞、郎罕氏细胞、NK细胞、内皮细胞等等。

2、分离细胞器

传统上，分离细胞器都是基于细胞器大小和密度的差异，在细胞匀浆后应用密度梯度离心来实现的。但是，许多平滑膜泡没有密度差异，很难用此方法分开。另外，许多新发展起来的细胞和分子生物学技术必须用体外培养的细胞。

这些细胞往往不易匀浆。应用免疫磁珠技术则可避免种类缺陷。在海得堡的欧洲分子生物实验室（EMBL）发展了一种应用免疫磁珠分离细胞器的“磁性自由流式系统”（Magnetic Free Flow Systen，MFFS），在整个分离和后续洗涤过程中，磁珠始终分散在整个稀释悬浮液中。

调节磁场至一个合适的强度，使洗涤液自由流下的同时磁珠及其吸附物维持于瓶中，这种方式可以避免对所要分离的膜泡的损伤，因为它省去了反复浓集和重新悬浮的过程。

EMBL用一对简单的抗原/抗体模型对MFFS的条件进行了优化，结果表明，他相对于传统的分离方法具有受率高、非特异吸附少、对结合物损伤小等优点。他们用此方法进行了高尔基体、内质网等的分离。

3、在微生物学上的应用

免疫磁珠在微生物学上也有广泛的用途，通过免疫反应结合于磁珠上的微生物通常可保持活性，提供给适当的营养就可以大量扩增。过程一般是将免疫磁珠与样品混合，培养10～30min，外加磁场提取结合有活微生物的磁珠。

在注入合适的培养基前可以进行洗涤，单抗和多抗都可以应用。免疫磁珠技术有很多优点：将靶细菌从环境中分离出，从很大的体积浓集至适于培养的体积；将样品中的生长抑制因子从细菌中清除去，有利于细菌的生长；当样品中既有病原菌，又有大量非致病性变种时，选择性培养基在分离靶生物时经常无能为力，而免疫磁珠在选择性分离拥有与致病力有关的特异抗原决定族的菌种方面具有很大的潜力。

结合于磁珠上的细菌可以直接在显微镜下进行分析，如对脆弱链泡囊菌、大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌等的检测；也可以与其他检测方法结合起来进行分析。

Cudjoe等首先用免疫磁珠分离出培养基和临床样品中的毒素，然后在免疫磁珠上直接用ELISA（LMB-ELISA）进行检测，他建立了用IMB-ELISA检测事物中的沙门氏杆菌的系统，对于热处理后的熟食品，增菌后的培养中仅含微量竞争肠道菌群，浓缩后可直接用IMB-PCR进行检测；

对于未经过热加工的生食品，其中含有较多的竞争微生物，要先用免疫磁珠进行分离，然后在方法的全部检测时间，包括制样时间在内不超过26h。最低检测限可达105/ml样品。阳性率高于ISO，IMS-Plating，Salmonella-Tek ELISA 等方法。Bennet等则对用IMB-ELISA分离检测食品中的大肠杆菌O157进行了评价。

而越来越多的人将免疫磁珠技术与PCR结合起来，称为IMB-PCR技术。影响PCR直接应用于临床诊断的一个因素是样品中的细菌浓度。另外，冻存过的样品中可能包含死菌，不适合培养，而应用PCR则可以很好地进行检测。

应用IMB-PCR进行检测的微生物包括：牙龈卟啉单孢菌、小肠结肠炎耶尔菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等。Grindede等则将免疫磁珠和转录PCR（RT-PCR）结合起来用以检测环境样品中的A型反转录病毒。

最近，Lvdnerbrg等人运用免疫磁珠设计了一种固相分析技术，通过比色来检测DNA，称作固定型放大了一种固定型放大核酸检测（Dectection of Immobilized Amplifiend Nueleic Acid，DIANA）。

运用这种技术可以省略去通常为排除背景干扰所要进行的电脉、内切酶谱、杂交等步骤。如果在靶区加入内标乳糖朝操纵子，然后同时扩增，即可进行定量分析。

最近，市场上出现了一种将免疫磁珠和电化学发光传染器（IMB-ECL）结合起来的自动检测系统ORIGEN，首先用免疫磁珠捕获靶物质，再用夹心的方法联上钌的三（二吡啶）螯合物Ru（bpy）2+3标记的rporter抗体，用磁场浓集后用电压激发出电化学发光。

Gatto等用它来检测各种生物毒素和细菌芽孢，分析A型肉毒杆菌毒素、霍乱β亚基、蓖麻毒素、葡萄球菌内毒素B等的检测限可达fenmtogran （10-15g）。分析炭疽杆菌芽孢时，可检测到100个芽孢。

4、分子生物学上的应用

应用于分子生物学上的磁性微球表面不是连接抗体，而是连接亲和素，通过亲和素-生物素反应与靶核酸相连。原理与免疫磁珠相似，只不是过将抗原-抗体反应换为配体-配基反应，可以称作亲和磁珠。亲和素-生物素之间的结合力非常强（Kd=10-15），有利于操作。

解链、提取、杂交（用碱或升温）等都不会干扰DNA和磁珠之间的连接。为将生物素插入DNA链中，可以来用生物素化的引物或用Klenow聚合酶和生物素化的核苷酸进行末端标记。亲和磁珠在分子生物学上的应用可归纳于下面几个方面。

（1）纯化DNA结合蛋白

连接有特异核苷酸序列的亲和磁珠与样品反应，提取出结合蛋白，再加入高盐溶液就可以将纯化蛋白洗脱下来，磁珠可以反复使用。Gabrielsen等用亲和磁珠纯化DNA结合蛋白（酪母转录因子ⅢC），通过磁性分离，洗涤和洗脱，可以得到高纯蛋白，三次吸附过程仅用1h。

（2）纯化PolyA+mRNA

将PolyT直接共价连接于或通过亲和素-生物素连接于磁性微球上即可用于分离PolyA+mRNA，分离后的mRNA可以用洗脱液或加热的方法解离下来。优点是不应用可能发生堵塞的柱子，终体积的终浓度可以控制。

（3）DNA序列分析

将亲和磁珠和PCR结合起来可以进行DNA测序。这种方法特别适于自动化，可以很快地制备大量样品，供应给装有加热/冷却系统的工作站进行测序。已经应用于巨细胞病毒、沙眼衣原体、恶性疟原虫、HIVI型病毒，人类基因等。

（4）固相克隆

应用亲和磁珠的固相克隆可以克隆任何片断、任何位点，不需限制性内切酶和连接酶，可以得到较高收率的重组片断。用此方法从人染色体克隆人类啊朴脂蛋白E基因片断，可以获得90%以上的正确重组体。

（5）体外诱变

体外诱变有很多方法，大部分采用核苷酸介导的诱变，可以使DNA特定部位精确改变。Hultman等描述了一种运用磁性分离技术的体外诱变方法。

这种诱变方法的优越性是无论用否PCR均可得到相同的结果，考虑到在克隆PCR产品时，累计聚合酶错误是一个必须注意的问题，这种用非PCR方法获得vector的固相方法非常有吸引力。另外，磁珠还用于单链DNA探针的标记和genomic Walking等。

5、用免疫磁珠清除自身免疫型精子

Foresta、Shulmand等应用免疫磁性微球来清除自身免疫不育病患者精液中带有自身抗体的精子，希望有净化的精子进行体外或受精来治疗自身免疫不育症。Vigano发现，这种方法可以清除掉50%的IgL标记的精子，精子运动和完整性实验证明磁珠对精子的性质没有影响。Ohashi等则用免疫磁珠进行了分离顶体反应精子的尝试。

6、用IMB-PCR检测循环系统中的癌细胞

血液是癌扩散的一个重要途径，对血液中癌细胞的检测可能成为临床医生预测癌症复发、选择更加合适的辅助治疗方法的重要工具。Hardingham等发展了用IMB-PCR来检测血液中分离出癌细胞，用PCR-RFLP检测细胞k-ras基因的第12密码子的突变情况。

可以重复地检测出样品中小于10pg的DNA（〈lcell〉。在随后的临床实验中，用此方法对27例编码突变病人的血液进行了检测。9例发现有癌细胞的病人中，7人因为复发后转移而死亡。其余18例发现有癌细胞的病人中，16人没有复发（中期检查：16个月，范围7～42个月）。

Kaplan-Meier分析表明血液中K-ras突变细胞的检测结果与无病存活期显著相关（p=0.0001）。Mass等则用IHB-RT-PCR对人乳腺癌细胞中广谱抗药基因1（MDR1）的信使RNA水平进行了检测。