siRNA实验操作成功要点

1. 对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列

为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。

2. 选择低GC含量的siRNA

Ambion公司研究发现GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。

3. 纯化体外转录siRNA

在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱(Ambion siRNA体外合成试剂盒中已包括纯化柱保证siRNA纯度)或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。

注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。

4. 避免RNA酶污染

微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品…因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。Ambion公司在这方面有一整套的产品线，如除RNA酶的喷剂，拭纸及液剂，检测和去除RNA酶。

5. 健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

6. 避免适用抗生素

Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。QIAGEN推出的专门针对RNA转染的试剂

7. 选择好的转染试剂转染siRNA

针对靶细胞类型，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。siRNA实验要求选择适合转小的RNA的转染试剂(目前大多数转染试剂都针对转染比较大的质粒DNA，而非小的RNA分子，宿主范围大小也不同)。

Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是专门针对转siRNA优化的转染试剂，是您的理想选择。

8. 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件

对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA)，转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多种靶基因的阳性siRNA。

9. 通过阴性对照siRNA排除非特异性影响

合适的阴性对照可通过打乱活性siRNA的核苷酸顺序设计而得。必须注意它要进行同源比较确保相对所要研究的生物的基因组没有同源性。

10. 通过标记siRNA来优化实验

荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。