琼脂糖凝胶电泳技术
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天然琼脂(agar)是一种天然多聚糖,主要由琼脂糖(agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。
琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷,而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,由于这些基团带有电荷,在电场作用下能产生较强的电渗现象,加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。
因此,目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下:
4. 电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定,制成干膜可长期保存。
目前,常用琼脂糖作为电泳支持物,分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合,发展成免疫电泳技术,能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系,由于建立了超微量技术,0.1 ug 蛋白质就可检出。
琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸,如DNA鉴定,DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便,设备简单,需样品量少,分辨能力高,已成为基因工程研究中常用实验方法之一。
琼脂糖浓度(%) | 0.3 | 0.6 | 0.7 | 0.9 | 1.2 | 1.5 | 2.0 |
线状DNA大小(kb) | 60-5 | 20-1 | 10-0.8 | 7-0.5 | 6-0.4 | 4-0.2 | 3-0.1 |
琼脂糖浓度与DNA分离范围
不同构型DNA的移动速度次序为:供价闭环DNA(covalentlyclosedcircular,cccDNA)>直线DNA>开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0(Rm=0),而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0),由此可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。
(5)电泳:琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果较好。在低电压条件下,线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是,在电场强度增加时,较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。
因此随着电压的增高,电泳分辨率反而下降,为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳,只有当凝胶浓度低于0.5%时,为增加凝胶硬度,可在4℃进行电泳。
生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行分子杂交,但琼脂糖不适合于进行杂交操作,1975年,Southren创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC膜)上,再进行杂交的方法,被称为Southren印迹法。
随后,Alwine等将类似方法用于RNA印迹,被戏称为Northern印迹。
1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置,将蛋白质转移到膜上,再与相应的抗体等配体反应,被戏称为Western印迹,这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状,用低电压高电流电泳完成转移。1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上,称Eastern印迹。
进行印迹转移电泳时,要注意缓冲液的离子强度要低,pH要远离pI,使蛋白质带有较多电荷,一般用稳定性较好的Tris-缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间有能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度,但亦会增加热效应,故电压或电流不可过高。
1983年Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间(外推为0的滞留时间)与DNA分子大小有关的特性,设计了脉冲电场梯度凝胶,交替采用两个垂直方向的不均匀电场,使DNA分子在凝胶中不断改变方向,从而使DNA按分子大小分开。
后来Carle等改进了电泳技术,并发现周期性的反转换电场(periodicinversionoftheelectricfield)亦能使大分子DNA通过电泳分开。电泳系统是由一水平式电泳槽和两组独立、彼此垂直的电极组成,一组电极负极为N,正极为S;另一组负极为W,正极为E。
一块正方形琼脂糖凝胶板(10cundefined10cm或20cundefined20cm)呈45度放中央。电场在N-S和W-E之间交替建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大小有关。电泳时,DNA分子处在连续间隔交替的电场中。首先向S极移动,然后改向E极。在每次电场方向改变时,DNA分子就要有一定的时间松弛,改变形状和迁移方向。只有当DNA分子达到一定构型后,才能继前时。DNA分子净移动方向与加样线垂直,使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万碱基对的大分子DNA。较新式的仪器电极间的角度和脉冲时间均可调,使用更加方便。