原核表达--GE

讲起通用电气医疗集团(GE Healthcare)也许生物方面的研究人员会比较陌生，这个从爱迪生的灯泡讲起，拥有百年历史的大集团包括许许多多的行业（当然也不要盲目崇拜把通用汽车也归到旗下，GM会生气的），可是讲起蛋白纯化等领域首屈一指的安玛西亚。

特别是ECL系列和当年的法玛西亚的Sepharose、Sephadex等大名鼎鼎的纯化填料，那么许多做蛋白的人都很熟悉。

美国通用电气公司2003年10月以总计高达95亿美金获得安玛西亚公司100%的控股权，这就是轰动一时的仪器行业内最大的收购案之一。

选择GE的表达载体原因很简单，爱屋及乌，使用他们的载体可以方便下一步的纯化。虽然在这几篇的介绍中没有强调纯化这个步骤，但是这不是因为纯化不重要，而是因为它太重要了。

涉及的内容太多，根本可以作为一门学科来了解，所以就不把“战线”拖那么长了。但是在选择表达系统的时候，表达后的纯化方法是必需考虑的非常重要的问题。

之前我们提到的经常用于标记的蛋白包括有硫氧还蛋白、6×组氨酸、谷胱甘肽S转移酶（GST）等，6×组氨酸可以说是被应用的最为广泛的了，次之就是GE医疗有专门设计的一系列载体的GST了。

GST本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到一种促进表达量提高的作用。

6xHis tag因为分子量很小且通常认为不会显著影目标蛋白的活性，在不太严谨的实验中经常不需要切割就可以继续分析目标蛋白（严格的实验还是必需切割下来的）。但是GST相比6xHis tag 分子量要大得多，必需要用蛋白酶将融合蛋白中的GST切下来。

对于表达分子量小的目标蛋白来说选择GST就比6xHis tag 更有优势――融合蛋白分子量较大的比较不容易被降解，另外有时天然蛋白里可能存在5个连续的组氨酸（或者非常靠近的6个His）因而也会被6xHis纯化填料吸附而“混入”纯化队伍中，而GST纯化填料的专一性则非常高。

顺带提一句，GST融合表达得到的包含体经过纯化后在复性的过程中添加适量的谷胱甘肽明显有助于提高融合蛋白的复性比率（在还原剂不影响二硫键的条件下）。选择GST载体的同志不可不知。

GST系列可是说是GE医疗在原核表达这块的王牌产品，总共有13个载体。这13个载体中有9个的多克隆位点是扩展过的，有6个限制性酶切位点。扩展后的多克隆位点方便我们从λ噬菌体载体构建的文库中将所需的基因克隆出来并定向插入到表达载体中。

所有载体上都带有可以将GST切割下来的蛋白酶识别位点，不同载体携带的蛋白酶不同，可以分成T系列、X系列和P系列，分别代表采用凝血酶Thrombin、Xa因子蛋白酶以及GE医疗产的PreScission™蛋白酶作为蛋白酶切割位点。

前面两个都是非常经典的融合表达载体的蛋白酶切割位点，但是由于这两种蛋白酶切割需时较长而且要求在室温条件下切割GST，容易导致目标蛋白降解，另外蛋白酶的去除也是比较烦人的问题，所以GE公司就推出了新的系列：PreScission。

P系列载体是用PreScission™酶进行切割，它的消化温度只要5℃，可以最大程度减小对目的蛋白的降解作用。因为这个蛋白酶本身通过基因操作也加上了一个GST标记，所以它可以和被切下来的GST残余部分一起通过谷光甘肽凝胶柱（Glutathione Sepharose™）纯化去除。

这样就可以极大程度上简化了纯化的步骤，从这里可以再次看出GE医疗产品在设计上很多时候总是考虑到下一步的纯化步骤的。pGEX-6P有三种载体，以方便你从不同的酶切位点插入都不会造成移码突变。

另外值得一提的是pGEX-2TK是专门为了体外标记融合产物以检测表达情况而设计的。它含有来自心肌的cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位的识别位点，这个位点位于GST和多克隆位点之间。

表达的蛋白可以直接用蛋白激酶和[g-32P]ATP进行标记，产物可以用放射自显影技术稳定地检测。它的GST可以用凝血酶切除。

总的说来，pGEX所有载体都提供了三种不同的翻译读码框选择；都是利用乳糖操纵子调控模式，启动子都是Ptac。Ptac是由trp启动子的-35序列和lacUV5的Pribnow序列拼接而成，调控和lac一样，但是mRNA转录水平更高，表达也更高，也都利用IPTG进行诱导表达。

IPTG本身有毒而似乎不适合表达医药用途的蛋白。这系列载体都是利用氨苄青霉素进行筛选。其中pGEX-1lT，pGEX-6P-1，pGEX-4T-1和pGEX-5X-1都可以接受来自l gt11文库的cDNA片断并进行表达。

在表达后的检测和纯化方面，GE医疗的产品堪称经典。无论是Western Blot检测表达，还是五花八门的纯化亲和层析柱，还有分离凝血酶等丝氨酸蛋白酶的苯甲脒凝胶柱，即使GE医疗没有6×组氨酸标记的载体，但是6×组氨酸亲和纯化相关产品却绝对出色。

大家做原核表达的目的是各式各样的，有用来做抗原；也有需要表达量大，并且需要活性的产物。纯化是表达后绝对不可小视的一步。所以，回到开场白“因为纯化爱上你”，就是选择pGEX的最好理由吧！