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细胞培养面面观

丁香园

2840

1、首先说清洗:对于玻璃器皿(如移液管、盖玻片之类)可先用酸液浸泡24h以上,再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍,除去残留酸液,再用双蒸水冲洗3-5遍,彻底洗净后放入不锈钢筒中,双层牛皮纸扎口,高压灭菌20min,烘干待用。

我们实验室的酸液一般是次强酸液(重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL)配液时要小心烫伤。

装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净,临用时再次用清水冲洗3-5遍,再用双蒸水漂洗3次,洗净后瓶口盖上锡箔纸,外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min,与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。

培养基过滤器灭菌同瓶子,也要在用完后及时洗净、灭菌时保持密封。Tip头就容易了,插到盒子里,双层牛皮纸包好后直接高压灭菌就好了。

2、再说说除菌:我说的除菌主要是指溶液的除菌。如PBS、HEPES之类的一些缓冲剂和不含葡萄糖的盐溶液,可以配好以后直接高压灭菌。而大部分的溶液由于成分限制必须过滤除菌。我们实验室需要过滤除菌的溶液有:胶原酶、胰酶、各类血清、抗生素、G-418溶液、各类培养基、各类生长因子、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。

3、关于各类溶液的配制:我列出我们实验室常用试剂的配方

1XPBS:氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸二氢钠1.15克、磷酸氢二钾0.2克,加水至一升,调pH=7.4。这里我认为PBS的pH是最重要的一环,不可大意。

HEPES溶液:8克氯化钠、0.3克氯化钾、0.135克磷酸氢二钠、1克葡萄糖、5克HEPES加水900ml,调pH=7.4

抗生素:我们主要用青霉素和链霉素,一般用1XPBS稀释至1X105单位,-20度储存,用时直接加入培养基,工作浓度一般为1X102单位。

G-418:1克包装的G-418瓶中加入10mlHEPES溶液彻底溶解,过滤除菌后分装于EP管,-20度保存。

谷氨酰胺:L-谷氨酰胺29.2克,加Hanks‘BBS1000ml溶解,配成200mmol/L过滤除菌,4度保存,工作浓度1~4mmol/L。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。

1XEDTA-胰酶:0.25克胰酶加0.1克EDTA完全溶解于500ml 1XPBS中,过滤除菌后分装于50ml离心管中,一管4度备用,其他-20度保存。我不太主张配成10X的母液,因为胰酶反复冻融后,效果会差很多。(EDTA很难溶,必要时候可放置过夜)

MTT:sigma公司出产,用1XPBS配成50mg/ml待用。MTT毒性很大,配置时务必小心。

各类培养基:现在我们实验室都是买GIBICO的粉剂自己配制。包装盒上会有配制方法,以及加碳酸氢钠的量。按说明来就是了。需要注意的是在配培养基前,最好先确保碳酸氢钠充分溶解,避免局部pH偏高或偏低。SmileSmile

再一个就是水的使用,一般配盐溶液,用三蒸水即可,而配制培养基务必用超纯水,并在使用前要高压灭菌。

4、关于培养基的选用:我养过的细胞株不多,权当抛砖引玉吧。

一般来说大部分细胞系我们都用高糖DMEM+10%FCS培养,我们实验室用该培养基的有:HepG-2、NIH-3T3、A549、Hela、C2C12、COS-7。特殊的,如P19Cl6用α-MEM+10%FCS,SGC-7901用RPMI-1640+10%FCS,293细胞则用MEM+热灭活的马血清。

对于贴壁不是很紧的细胞,用45%DMEM+45%α-MEM+10%FCS有奇效~

5、操作中的一些小细节

实验进行前,无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30分钟灭菌,以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转数分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,以避免失误混淆或细胞间污染。

实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转5分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。

无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。

实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。

小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45° 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

定期检测下列项目: CO2 钢瓶之CO2 压力 、CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)、无菌操作台内之airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000 小时/HEPA)、液氮罐中的液氮高度。

水槽可添加饱和硫酸铜溶液,并定期换水。

6、血清的相关问题

血清必须贮存于–20℃,若存放于4℃,不要超过一个月。如果一次无法用完一 瓶,可将40~45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中,预留此膨胀体积之空间,以免容器冻裂。

一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。

瓶装(500ml) 血清一定要逐步解冻: 4℃冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份 去活化。除非必须,一般不要作此热处理,因为会造成沉淀物之显著增多,且会影响血清之品质。以我们实验室做的对照试验看,未灭活血清效果的确要好些。

7、贴壁细胞传代培养

一般步骤为:真空泵吸走培养基,1XPBS漂洗两次,加入1mlEDTA-Tripsin(100mm皿为例),37度放置数分钟,轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量血清,以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,离心后加入新鲜培养基,按比例转移至新皿。

细胞的传代最重要的是胰酶处理时间,若胰酶处理太久,容易造成细胞贴壁不紧,显微镜下观察立体感不强,严重的时候甚至会造成细胞死亡。我谈谈个人经验:HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长,一般处理5-6min,C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落,2min足矣,P19Cl6和293细胞贴壁不紧,可在PBS漂洗后,直接换新鲜培养基打散。

8、细胞冻存及复苏

首先说冻存液配方,常用的配方一般是两种——90%FCS+10%DMSO或70%培养基+20%FCS+10%DMSO。前一种较贵,而且后一种冻存效果也不错,因此本人一般选用第二种配方。对于比较脆弱的细胞则选用前一种冻存液。

冻存步骤比较简单,前期处理同细胞传代,只是在离心后是直接吸取上清,用手拍打离心管底部,加入适量冻存液使细胞完全悬浮后分装于冻存管。

制后先将冻存管放入4℃冰箱,约40min。 接着置于-20℃冰箱,约60min。置于-80超低温冰箱中放置过夜。 最后置于液氮罐中长期保存。 同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。

注意事项:

1>使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构,以至于降低冷冻保护效果。

2>冻存时要选处于对数生长期的细胞,这样效果要好很多

3>不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危险温区”。

4>注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。

5>冻存液中的培养基要与培养时相同,避免细胞由于环境突然改变而死亡,在冻存管上也要标明培养基种类。

6>冻存液不要预热。

7>程序冻存盒非常好用,省事省时效果还好,强烈推荐冻存使用冻存盒。

细胞复苏的原则是快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。

具体步骤:

1.将水浴锅预热至40℃

2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

4.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

5.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。

6.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。

7.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,

8.平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3min

9.吸弃上清液。

10.向冻存管内加入1ml培养液,吹打制成细胞悬液。

最后将细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内12-24小时后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。

注意事项:

1>复苏时选用的培养基要符合冻存管上标明的培养基。2>操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。3>自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。

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