细胞培养面面观
丁香园
1、首先说清洗:对于玻璃器皿(如移液管、盖玻片之类)可先用酸液浸泡24h以上,再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍,除去残留酸液,再用双蒸水冲洗3-5遍,彻底洗净后放入不锈钢筒中,双层牛皮纸扎口,高压灭菌20min,烘干待用。
我们实验室的酸液一般是次强酸液(重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL)配液时要小心烫伤。
装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净,临用时再次用清水冲洗3-5遍,再用双蒸水漂洗3次,洗净后瓶口盖上锡箔纸,外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min,与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。
培养基过滤器灭菌同瓶子,也要在用完后及时洗净、灭菌时保持密封。Tip头就容易了,插到盒子里,双层牛皮纸包好后直接高压灭菌就好了。
实验进行前,无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30分钟灭菌,以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转数分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转5分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。
定期检测下列项目: CO2 钢瓶之CO2 压力 、CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)、无菌操作台内之airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000 小时/HEPA)、液氮罐中的液氮高度。
水槽可添加饱和硫酸铜溶液,并定期换水。
7、贴壁细胞传代培养
一般步骤为:真空泵吸走培养基,1XPBS漂洗两次,加入1mlEDTA-Tripsin(100mm皿为例),37度放置数分钟,轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量血清,以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,离心后加入新鲜培养基,按比例转移至新皿。
细胞的传代最重要的是胰酶处理时间,若胰酶处理太久,容易造成细胞贴壁不紧,显微镜下观察立体感不强,严重的时候甚至会造成细胞死亡。我谈谈个人经验:HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长,一般处理5-6min,C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落,2min足矣,P19Cl6和293细胞贴壁不紧,可在PBS漂洗后,直接换新鲜培养基打散。
8、细胞冻存及复苏
首先说冻存液配方,常用的配方一般是两种——90%FCS+10%DMSO或70%培养基+20%FCS+10%DMSO。前一种较贵,而且后一种冻存效果也不错,因此本人一般选用第二种配方。对于比较脆弱的细胞则选用前一种冻存液。
冻存步骤比较简单,前期处理同细胞传代,只是在离心后是直接吸取上清,用手拍打离心管底部,加入适量冻存液使细胞完全悬浮后分装于冻存管。
制后先将冻存管放入4℃冰箱,约40min。 接着置于-20℃冰箱,约60min。置于-80超低温冰箱中放置过夜。 最后置于液氮罐中长期保存。 同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
注意事项:
1>使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构,以至于降低冷冻保护效果。
2>冻存时要选处于对数生长期的细胞,这样效果要好很多
3>不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危险温区”。
4>注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。
5>冻存液中的培养基要与培养时相同,避免细胞由于环境突然改变而死亡,在冻存管上也要标明培养基种类。
6>冻存液不要预热。
7>程序冻存盒非常好用,省事省时效果还好,强烈推荐冻存使用冻存盒。
细胞复苏的原则是快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。
具体步骤:
1.将水浴锅预热至40℃
2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
4.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
5.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。
6.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。
7.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,
8.平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3min
9.吸弃上清液。
10.向冻存管内加入1ml培养液,吹打制成细胞悬液。
最后将细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内12-24小时后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。
注意事项: