哮喘大鼠模型的制作和T淋巴细胞的分离

实验大鼠分组：

根据随机化原则，将24只雄性Wistar大鼠（体重190-250g） 按体重编号，采取随机排列表法分为以下4组：（1）正常对照组、（2）哮喘一周组（激发一周）、（3）哮喘两周组（激发二周）和（4）哮喘四周组（激发四周及以上）。

哮喘模型的建立：

第一天三组哮喘组大鼠每只大腿内侧皮下注射卵清蛋白（OVA）悬液1ml（OVA10mg+氢氧化铝200mg+0.9%生理盐水至1ml），同时腹腔内注射灭活百日咳杆菌悬液1ml （约6×109个菌株）作为佐剂，第8天重复致敏一次，第15天开始将大鼠置于自制玻璃容器中，隔日用402超声雾化器（上海四菱医疗器械厂）给于中等雾量的2%的OVA悬液50ml激发30分钟，每周至少3次，分别按分组激发1周、2周和4周及以上。

OVA悬液激发后以大鼠出现烦躁、呛咳、呼吸加快、行动迟缓或俯伏不动等症状以及肺内组织病理切片显示嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润，小气道和小血管收缩为哮喘激发成功。

正常对照组腹腔内注射等量PBS1ml代替OVA悬液，2周后雾化吸入中等雾量的PBS液50ml共30分钟，每天一次，共15天。

T 淋巴细胞的分离及体外培养：

对各组大鼠无菌操作行肠系膜下静脉穿刺采血10ml，分装于离心管后用等量PBS液稀释，然后缓慢加于等体积的淋巴细胞分离液上，使形成层次分明的界面。

2200rpm离心20分钟，可见层次分明的界面。吸出离心管中间的一层乳白色的液体，加入0.85%的氯化铵以破碎红细胞并室温静置2分钟，然后用PBS终止反应。 室温1800rpm离心10分钟，去除上清。

继续用PBS稀释液先后洗涤2次，每次1600rpm离心15分钟。

去除上清后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将沉淀调至1ml并轻轻吹打混匀，置37℃，5%CO2 温箱孵育1小时。

将细胞悬液进一步用无菌尼龙棉柱37℃，5%CO2 温箱培养1小时，分离出T细胞，台盼兰染色试验活细胞〉90%。

用含10%FBS的RPMI-1640培养液调整T细胞浓度为2×106/ml，接种于24孔培养板内，每孔各1ml，于5%CO2、37℃培养箱内培养。