真核转染

一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉,然而许多在 细菌 中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确,或因折叠效率低下,结果使得蛋白活性低或无活性.不仅如此,真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工,例如二硫键的精确形成、糖基化、 磷酸化 、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等,而这些加工原核细胞则无能为力.

需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白,例如位于 细胞膜 表面的受体或细胞外的 激素 和酶,则更需要使用真核转染技术.由于 DNA 导入 哺乳动物 细胞有关技术方法的发展,使真核表达成为可能.

利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达 蛋白质 ,具有以下多种不同用途：

（1）通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定,确证所克隆的基因.

（2）对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达.

（3）大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白.

（4）研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的情况.

（5）通过分析正常蛋白质及其 突变 体的特性,阐明蛋白质结构与功能的关系.

（6）使带有内含子而不能在原核生物如 酵母 中正确转录为 mRNA的 基因组 序列得到表达.

（7）揭示某些与 基因表达 调控有关的DNA序列元件.

DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具,已发展了很多转染方法,并成功应用于转染各种细胞.目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、 病毒 载体,以及阳离子 脂质 体介导转染法.

进行真核转染的一般程序：

克隆目的基因（经测序验证）－准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定下面以pcDNA3为载体,p16为目的基因,介绍真核转染的实验操作.

一、试剂准备

1、HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O,加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml,pH7.4,滤过除菌.

2、核酸贮存液,过滤除菌.

3、培养基：含血清或不含血清的,用于转染细胞的正常培养.