病毒计数仪Virocyt3100在病毒疗法中的应用

WHITE PAPER: Virotherapy Process Optimization

采用一系列方法将病毒工程开发用于疾病治疗已经成为一种新型的应用，该应用广泛的定义为病毒疗法，包括用于基因治疗的病毒载体(Figure 1)和具有溶瘤细胞功能的病毒。虽然这些产品大部分都处在临床开发阶段，但是药物作用靶点的多样性以及未来机会的财富都是令人鼓舞的。

病毒疗法是一门以病毒为基础的技术，一个重要的挑战就是在任何的时间点包括早期的研发，产品的生产，产品的包装上市都能清楚地了解样品的质量和性能，其中最重要的一点就是病毒的定量。

在过去，病毒的定量依赖于噬斑法和电镜等方法，这些方法需要大量的劳动力，等待很长时间才能获得结果，且获得的结果具有很大的主观性。然而，以新的病毒学技术的多样性为基础的病毒药物和疫苗需要新的分析方法。在这篇文章中，我们将讨论病毒计数仪3100实时的病毒浓度监测功能如何能显著的促进病毒疗法产品的开发。

Reprogramming Viruses to Treat Disease

基因治疗早在十几年前就已经出现，但是因为出过病人死亡的情况而受挫。幸运的是，在2006年基因治疗在临床上取得成功，所以基因治疗又称为大家研究的热点。目前已经有2000多个临床试验在许多不同的治疗领域和标志中进行或者已经完成。

基因治疗和其他病毒疗法最大的区别在于基因治疗会将人体的一段健康基因传递到病人细胞中取代一个非功能性的片段。依赖于此方法，这段健康基因可能会或者不会持续整合到宿主细胞基因组中。

相反，溶瘤细胞的病毒可以利用许多方法去彻底破坏肿瘤细胞，而不是改变被感染细胞的基因组成。溶瘤细胞病毒疗法包括裂解，刺激抗肿瘤免疫反应，编码能激活药物前体成为有效细胞毒素的酶，抑制血管生成和放射疗法敏化作用。

溶瘤细胞病毒疗法的作用原理和机制如Figure2所示，该图为Amgen公司所创，T-VEC 目前被用来研究黑色素瘤和其他晚期癌症的治疗，使用改进的疱疹病毒选择性感染癌细胞，分泌细胞细胞因子刺激免疫反应，已经在三期临床实验中显示了显著的成效。除了癌症，病毒疗法也被建议用来治疗其他疾病，如用噬菌体治疗细菌感染。

到目前为止，许多的病毒已经在病毒疗法应用中被评估过（见Table1）。

之所以选择这些病毒，是因为他们只瞄准特定的细胞类型或者适合基因操作。为了把这些病毒开发成基因传递载体或者治疗因子，必须将这些病毒放大培养，在培养过程中优化培养条件以获得最大的产量。

在整个过程中如接种，体积放大培养，收样，纯化，浓缩，病毒包装等都存在延误、中断的机会。由于许多病毒定量方法都需要好几天甚至好几周的时间，打断整个流程，所以病毒定量是一个大的瓶颈。

病毒计数仪3100(Figure 3)几分钟内就能提供精确的，可重复的病毒颗粒定量结果，能实时监测病毒的浓度。96孔板的自动上样系统，为GMP要求设计的软件能很好的满足大规模的病毒生产环境所需的条件。

Proof of Principle

病毒计数仪已经被广泛应用于多种病毒的计数，包括基因传递载体和溶瘤功能的病毒。这里我们列出一些检测的数据，证实病毒计数仪快速的病毒定量在病毒疗法领域的实用性。

病毒计数仪的精度通过检测系列稀释的病毒样品数据斜率和线性关系来测量。这个值越接近1，说明这个机器产生的数据越可信，越能反映病毒浓度的真实性。

Figure 4 证实了这个实验，在这个案例中检测的是水痘病毒。3个不同的样品分别检测了11稀释度，斜率分别为－1.0845，－1.0846，－1.14，R2 分别是0.995, 0.997 and 0.996，显示出良好的精确性。

在下一个例子中，一个客户想跟踪HeLa细胞培养的麻疹病毒的浓度。他们采用病毒计数仪测量总的病毒颗粒，用TCID50（这个方法需要5-7天的时间）测量病毒的感染性,并比较了两者之间的关系（Figure 5）。

与大部分的病毒类似，有感染能力的麻疹病毒的数量只是总的病毒群体中的一小部分，在这个例子中只有0.6% to 1.7%，暗示了此批次培养的病毒大部分是非感染性的病毒。有趣的是，在病毒感染后，细胞培养了120多个小时后，感染性病毒数量明显下降，而病毒总量却保持稳定不变，暗示病毒的感染效力会受到培养时间延长的不利影响。

此外，利用病毒计数仪跟踪定量麻疹病毒在纯化的每个步骤中病毒颗粒的浓度（Figure 6）该实验阐明了病毒的实时定量在病毒纯化优化，避免错误发生的重要性。没有病毒计数仪的实时监测，任何人在生产病毒疗法的药剂时都是在黑暗中摸索，冒着百万美元损失以及需要安全有效产品进行治疗的病人的健康风险。