缓冲液的配制

缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。PH缓冲系统对维持生物的正常pH值，正常生理环境起重要作用。

多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。

在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。

由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。

生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。

硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。

柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。

磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。

三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力很差。

缓冲液的pH值由哪些因素决定？

设缓冲系统的弱酸的电离常数为K（平衡常数），平衡时弱酸的浓度为[酸]，弱酸盐的浓度为[盐]，则由弱酸的电离平衡式可得下式：

根据此式可得出下列几点结论：

（1）缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数K及盐和酸的浓度有关。弱酸一定，但酸和盐的比例不同时，可以得到不同的pH值。当酸和盐浓度相等时，溶液的pH值与PK值相同。

（2）酸和盐浓度等比例也增减时，溶液的pH值不便。

（3）酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，一般地说缓冲液有效缓冲范围为PK±1pH。

从上述可知，只要知道缓冲对的PK值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度）时，可按公式计算出[盐]和[酸]的量。这样算涉及到对数的换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，经计算已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。

讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。

经查表知pH5.8浓度为0.2M Na 2 HPO 4 8.0毫升，而0.2M Na 2 HPO 4 92.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na 2 HPO 4 8.0毫升，而0.1M Na 2 HPO 4 需要92.0毫升。

所以500ml 0.1M磷酸缓冲液需要Na 2 HPO 4 量为:

需Na 2 HPO 4 量为 :

计算好后，按计算结果称好药品，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，便得所需的缓冲液。

各种缓冲溶液的配制，均按下表按比例混合，某些 试剂 ，必须标定配成准确的浓度才能进行，如醋酸、NaOH等。

（1）醋酸盐缓冲溶液

PH	M/S 醋酸钠 (毫升数)	M/S 醋酸 (毫升数)	PH	M/S 醋酸钠 (毫升数)	M/S 醋酸 (毫升数)	PH	M/S 醋酸钠 (毫升数)	M/S 醋酸 (毫升数)
3.2	1	32
3.4	1	16	4.4	9.4	12.6	5.4	17.1	2.9
3.6	1.5	18.5	4.6	9.8	10.2	5.6	18.1	1.9
3.8	2.4	17.6	4.8	12.0	8.0	5.9	19	1
4.0	3.6	16.4	5.0	14.1	5.9	6.2	19.9	0.1
4.2	5.3	14.7	5.2	15.8	4.2

（2）磷酸盐缓冲液的配制

1/15M的Na 2 HPO 4 溶液（11.876克纯的Na 2 HPO 4 ·2H 2 O溶于1升蒸馏水中）及1/15M的KH 2 PO 4 溶液（将9.078克KH 2 PO 4 溶于1升水中）将着两种溶液依不同比例混合。

PH	Na 2 HPO 4 （ml）	KH 2 PO 4 （ml）	PH	Na 2 HPO 4 （ml）	KH 2 PO 4 （ml）	PH	Na 2 HPO 4 （ml）	KH 2 PO 4 （ml）
4.94	0.1	9.90	6.46	4.00	6.00	7.73	9.00	1.00
5.29	0.25	9.75	6.81	5.00	5.00	8.04	9.50	0.50
5.39	0.50	9.50	6.98	6.00	4.00	8.34	9.75	0.25
5.91	1.00	9.00	7.17	7.00	3.00	8.69	9.90	0.10
6.24	2.00	8.00	7.38	8.00	2.00	9.18	10.00	0.00
6.47	3.00	7.00

(3)Tris 缓冲溶液

贮备液

溶液A：0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷）

溶液B：0.2M HCl

50mlA＋XmlB，用蒸馏水稀释到200ml

pH	X（ml）	pH	X（ml）
7.2	44.2	8.2	21.9
7.4	41.4	8.4	16.5
7.6	38.4	8.6	12.2
7.8	32.5	8.8	8.1
8.0	26.8	9.0	5.0

（4）磷酸盐－柠檬酸缓冲液的配制

0.2M Na 2 HPO 4 ·2H 2 O溶液及0.1M柠檬酸溶液，并依不同比例混合（见表）

pH	Na 2 HPO 4 （ml）	柠檬酸 （ml）	pH	Na 2 HPO 4 （ml）	柠檬酸 （ml）
2.2	0.40	19.60	5.2	10.72	9.28
2.4	1.14	13.76	5.4	11.15	8.85
2.6	2.18	17.82	5.6	11.60	8.40
2.8	3.17	16.83	5.8	12.09	7.91
3.0	4.11	15.89	6.0	12.63	7.37
3.2	1.94	15.06	6.2	13.22	6.78
3.4	5.70	14.30	6.4	13.85	6.15
3.6	6.44	13.56	6.6	14.55	5.45
3.8	7.10	12.90	6.8	15.45	4.55
4.0	7.71	12.29	7.0	16.47	3.53
4.2	8.28	11.78	7.2	17.39	2.61
4.4	8.82	11.18	7.4	18.17	1.83
4.6	9.35	10.85	7.6	18.73	1.27
4.8	9.86	10.14	7.8	19.15	0.85
5.0	0.30	9.70	8.0	19.45	0.55

(5) 盐缓冲液的配制

a、M/20硼砂（10.108克Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O溶在一升水中）

b、M/5硼酸＋M/20NaCl（12.45克H2BO＋2.925克）NaCl在一升水中（见下表）

pH	a(ml)	b(ml)	pH	a(ml)	b(ml)
7.0	0.45	9.55	8.2	3.5	6.5
7.2	0.75	9.25	8.4	4.45	5.55
7.3	1.10	8.9	8.6	5.5	4.5
7.8	2.05	7.95	9.0	8.2	1.8
8.0	2.70	7.3

(五)药品规格及其应用范围

根据药品纯度不同一般可分为下列几类：

（1）保证 试剂 （G、R）用在科学研究及微量分析方面

（2）分析试剂 （A、R）定量分析时标定溶液用

（3）化学纯试剂（C、P）定性试验时用

（4）实验试剂 （L、R）用于和实验结果关系不大的场合

（5）工业品 用于大型或工业生产上

在实验中用的最多的是C、P一类，A、R使用较少，G、R非有特殊需要时，一般尽量用A、R来代替，因为纯度高，价格很贵。

除上述几种规格外尚有几种不以纯度分类的规格：

（1） 生物 试剂 （B、R） 生物 体中提炼出来，成分含量相差较大，如培养微生物时用牛肉膏，酵母膏等药品即属此类。

（2）指示剂（Ind）配制指示剂用

（3）层析纯，色层分析时采用

（4）生物染色剂BS如甲基兰

（5）常用标准溶液的配制与标定

(1)0.1mol/L NaOH溶液

1、配制方法：

1）氢氧化钠中含有碳酸钠，所以不能直接配成纯溶液，因碳酸钠几乎不溶于饱和的氢氧化钠溶液中，故可以先配成饱和的氢氧化钠溶液（约19mol/L）而将沉淀弃去。

另一个方法可加氯化钡110克溶于100ml水中配成饱和溶液，入瓶内密闭瓶塞，放置1－2天，使碳酸钠沉淀，取上层清夜6.3ml加入刚煮沸过冷却的 蒸馏 水750ml，可得浓度约为0.1N氢氧化钠溶液。

2）称氢氧化钠结晶5克（或干燥棒状，或小片状得氢氧化钠5克）置于4000ml烧杯中，加水300ml，使之溶解，加热并缓缓加入1mol/L氯化钡溶液200ml。将碳酸钡沉淀后，将上层溶液倾入1000ml量筒中，加入刚煮沸冷却的 蒸馏 水，稀释至1000ml刻度处，放置使沉淀下沉，取其上清液。

NaCO 3 ＋BaCl 2 →BaCO 3 ＋2NaCl

2、标定

取分析纯的苯二酸氢钾（KHC8H4O4）置于称量瓶中，于 烘箱 内105－110℃下加热2小时，取出后放入干燥器内半小时，用倾出法在天平上称出约0.45克，称准至小数点第四位，共称两份，分别放入150ml三角瓶中。

各加入25ml溶解后再加入1％酚酞指示剂3－4滴，然后配制好的氢氧化钠溶液装入滴管中，滴定上述两种样品，其误差不得超过0.3％，否则重行标定，氢氧化钠浓度计算如下

式中：
W邻苯二酸氢钠…………………称取邻苯二酸钾的重量（克）

VNaOH……………………………滴定用去氢氧化钠毫升数

0.20442……………………………邻苯二酸氢钾的毫克当量。

（2）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液：

1、配制方法：

称取硫代硫酸钠（Na 2 S 2 O 3 ·5H 2 O）12.5克无水碳酸钠0.2克溶于煮沸后冷却的水中稀释到1000毫升，其浓度约为0.1mol/L，放置3－4天后才能进行标定。

2、标定：

取分析纯的碘酸钾置称量瓶中于 烘箱 中加热105－110℃两小时，移入干燥器内冷却，称出两份样品重量为0.07－0.08克（标准至小数四位）于250ml三角瓶中，各溶于50ml水中，待完全溶解后。

各加入30％碘化钾溶液10ml，12mol/L硫酸10ml，放置3分钟，稀释至150ml，用上述配制的硫代硫酸钠溶液滴定至草黄色，加入1％淀粉指示剂5ml继续滴定至兰色消失，记录硫代硫酸钠溶液的用量。

另取30％碘化钾溶液10ml，12mol/L硫酸10ml，加水至150ml加入淀粉指示剂5ml，用硫代硫酸钠滴定，作为空白试验：

硫代硫酸钠溶液计算如下：

WKIO 3 …………………称取碘酸钾的重量（克）
VNa 2 S 2 O 3 …………………滴定用去硫酸钠溶液的毫升数
VNa 2 S 2 O 3 …………………空白实验用去硫代硫酸钠溶液的毫升数。
214.2………………………KIO3的克分子量
6…………………………KIO3的当量

注：硫代硫酸钠溶液易被空气氧化，如溶液中有硫细菌时，也能使硫代硫酸钠分解，而光线使硫细菌生长，此外硫代硫酸钠亦能与CO2作用，所以此溶液在放置过程中浓度逐渐降低，所以此溶液应放置在棕色瓶中密闭瓶塞。所以每隔一定时间应重新标定一次。如发现溶液浑浊（析出硫磺）就不能再用。

（3）0.1mol/L高锰酸钾溶液

1、制备方法：

称取分析纯高锰酸钾3.2克入1000ml 烧杯 中，加400ml水加热溶解，然后稀释至一升，静置一周以上，用玻璃制成的虹吸管，吸取上层清液贮于棕色细口瓶中。
如为了缩短时间亦可用制备的溶液在接近沸腾温度下加热一小时，然后旋转过夜，次日用布氏漏斗或沙芯漏斗过滤。

2、标定：

称取分析纯草酸钠入称量瓶中，于烘箱中加热150℃1小时，然后正确称出0.25－0.30克两份于2个400ml 烧杯 中各加水100ml及12mol/L H 2 SO 4 20ml，使之溶解，并加热至80℃，然后用高锰酸钾滴定，开始时滴定速度不宜过快，只能滴几滴，搅拌均匀待红色退去后，再以每分钟20－25滴速度进行滴定，直至溶液呈粉红色，数分钟不退为止，滴定后溶液温度不宜低于60℃。

（4）0.2mol/L碘液

1、制备方法：

碘在水中溶解度很小，不可能达到0.2mol/L，当溶液中有碘化钾存在时，碘和碘离子结合称为溶解度较大的才行。

称取碘6.5克于500ml烧杯中加入13克碘化钾及水15ml（水不可多加，否则碘不能溶解完全），不时搅拌待碘完全溶解后，加水稀释至500ml，移入棕色瓶中，密闭塞紧置于阴暗处3－4天后再行标定。

2、标定：

准确称出在105－110℃烘二小时的分析纯亚砷酸（AS 2 O 2 ）0.200克（小心，有剧毒）两份于250ml三角瓶中，各加入6mol/L氢氧化钠5ml及水10ml，溶解后，再加6mol/L盐酸，用水稀释至总体积为100ml，再加入碳酸氢钠中和多余的酸，加1％淀粉指示剂5ml，然后用碘液滴定，其浓度计算如下：
WAS 2 O 2 …………………………称取亚砷酸的重量（克）
VI2…………………………………滴定用去碘液毫升数
0.04946…………………………亚砷酸的毫克当量