DNA分子的限制性内切酶消化

限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA 序列位点上并在此切割双链DNA 。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。

一些酶恰在对称轴处同时切割DNA 双链而产生带平端的DNA 片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA 片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA 所需的酶量。

不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。

一、限制性内切酶对DNA 消化的一般方案

1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

2.20μl体积反应体系如下：

DNA 0.2-1 μg

10×酶切buffer 2.0 μl

限制性内切酶 1-2 u（单位）

加ddH2O 至 20 μl

限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。

3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。

4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。

5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。

6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA 沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。

7.如要纯化消化后的DNA ，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。

二、电泳检测

取质粒酶切产物适量，加适当loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用 1-5V/cm的电压，使DNA 分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。

三、注意事项

1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。

2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。

3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。

4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA 时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。

5.注意星号酶切活力。