血清蛋白质的醋酸纤维薄膜电泳

【原理】

以醋酸纤维薄膜为支持物，用缓冲液润湿后，将微量血清样品点于膜上，再在电泳槽中进行电泳，可将血清蛋白分离成清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白五条区带，将薄膜置于染色液中，使蛋白质固定并染色后，可看到清晰色带，也可将色带分别于碱溶液中进行定量测定，再计算血清中各种蛋白质的含量百分数。

在正常情况下，这些蛋白质各占一定的百分比，在某些病理情况下，某些蛋白质的含量可发生改变，例如：肝硬化患者，清蛋白显著降低，γ-球蛋白可升高2~3倍；肾病综合症、慢性肾炎患者，清蛋白下降，α2-球蛋白、β-球蛋白升高。因此，血清蛋白电泳有一定的临床意义。

【操作】

1.薄膜准备：将薄膜切成2×8cm（或2.5×7cm）的小片，在薄膜的无光泽面一端1.5cm处用铅笔轻轻划一横线，表示点样位置，将薄膜浸入巴比妥缓冲液中充分浸透（浸泡5~10分钟或预先浸泡好，随时取用）后取出，夹于滤纸中，吸去多余的溶液。

2.点样：用血清加样器于无光泽面点样（微量吸管或玻片），沾取血清后垂直轻轻接触加样处，让血清吸入膜内，再拿开加样器。

3.平衡：待血清渗入薄膜，将薄膜无光泽面向下，两端平贴在铺有滤纸或纱布的电泳槽支持板上（加血清的一端贴在电泳槽阴极端）加盖，静置10分钟，使薄膜中的液体获得平衡。

4.电泳：

　　电压：约110~140V（或相当于电场强度10V/cm）。

　　电流：0.4~0.6mA/cm宽

　　时间：45~60分钟。

5.染色：电泳停止，关闭电源，将薄膜从电泳槽中取出，直接浸入氨基黑染色液中，染色3~5分钟，从染色液中取出薄膜，浸入漂洗液中漂洗脱色数次，至薄膜背景完全无色为止，取出薄膜用滤纸吸干。

6.定量：将漂洗后的薄膜夹于滤纸中吸干，剪下各蛋白区带，分别置于试管中，另于空白区剪一平均大小的薄膜放入空白管中，清蛋白管中加0.4MNaOH4ml，其余各加5ml，反复振摇使其充分洗脱，放30分钟后比色（波长650nm），以空白管调光密度到0点，读记各蛋白质的光密度值。

　　光密度总和（T）=2A+α1+α2+β+γ

　　A清蛋白%=（2A/T）×100%

　　α1球蛋白%=（α1/T）×100%

　　α2球蛋白%=（α2/T）×100%

　　β球蛋白%=（β/T）×100%

　　γ球蛋白%=（γ/T）×100%

7.透明保存：将染色漂洗后晾干的薄膜条浸入新鲜配制的透明液中经2~3分钟，贴在玻璃板上，干后即成透明薄膜，可保存或用吸光度计直接测定各区带的吸光度。

注：容易产生的几种现象

　　1.电泳图谱不齐：点样时血清滴加不匀。

　　2.电泳图谱出现条痕：点样后薄膜过干，或由于电泳槽密闭性不良，或电流过大造成水分蒸发，薄膜干燥。

　　3.分离不良：样品滴加过多。

　　4.区带拖尾：缓冲液离子强度小于0.05。

　　5.区带过于紧密：缓冲液离子强度大于0.075。

　　6.染色后清蛋白中间色线：染色时间不足，或清蛋白含量过高，此时可减少检样用量或延长染色时间。

　　7.球蛋白向反方向移动，系电渗现象，可升高点样中缓冲液液面高度，或适当加大电流量克服之。

　　8.透明时若膜不干或透明液中醋酸含量不足，膜即发白，不能完全透明；若透明液中醋酸含量过高，或室温过高，可使膜溶解，此时可酌情减少醋酸含量。

【试剂】

1.巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）：称取巴比妥钠12.76g及巴比妥1.60g，用蒸馏水加热溶解后，再加水至1000ml。

2.染色液：氨基黑10B0.5g，溶于50mL甲醇中，再加入冰醋酸10mL及水40ml。

3.漂洗液：用95%酒精45ml，加冰醋酸5mL及蒸馏水50ml，混合即成。

4.洗脱液：0.4MNaOH。

5.透明液：按3：7比例混合的冰醋酸-无水乙醇溶液需新鲜配制。