血清总胆固醇测定(高铁-硫酸显色法)
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1. 掌握高铁-硫酸显色法测定血清总胆固醇的原理和方法。
2. 了解血清胆固醇的正常值及临床意义。
【 实验原理 】
胆固醇（cholesterol）是环戊烷多氢菲的衍生物，它不仅参与血浆蛋白的组成，而且也是细胞的必要结构成分，在神经组织和肾上腺中含量特别丰富，在肝、肾和表皮组织含量也很多。胆固醇是生物膜和神经髓鞘的重要组成部分，是维持生物膜的正常透过能力不可缺少的。
胆固醇还可以转化成胆汁酸、固醇类激素和维生素D 3 等。胆固醇主要随胆汁从粪便排出体外。血液中的胆固醇仅有不到20%是从食物中摄取的，其余均由机体自身合成，肝、肠、肾、骨髓及内分泌腺等均是合成场所。
由于血液与组织内的胆固醇经常不断地交换，因此血清胆固醇水平基本能够反应胆固醇的摄取、合成及转送情况。胆固醇与动脉粥样硬化等有一定联系，据国外报道体内胆固醇长期偏低，是诱发癌症的因素之一。
因此，胆固醇的测定是临床最普遍检测项目之一。胆固醇在体内以游离胆固醇（free cholesterol,FC）及胆固醇酯（cholesterol ester，CE）两种形式存在，统称总胆固醇。
总胆固醇的测定方法目前已超过200种，可分为化学 试剂 比色法、酶分析法、荧光法、气相和高效液相色谱法等五大类。由于气相和高效液相色谱法条件高，临床实验室最常用的是化学 试剂 法和酶法。
化学试剂法一般包括抽提、皂化、纯化、显色比色四个阶段。
化学法测定总胆固醇的比色原理主要分三类：
①与醋酐-硫酸试剂产生蓝绿色。胆固醇酯和胆固醇在与醋酐-硫酸反应时呈色深浅不同，因此用这种方法测定结果偏高。
②与高铁-硫酸试剂产生紫红色。高铁-硫酸比色法灵敏度高，显色稳定，测定精密度好，是临床检验胆固醇推荐方法。但干扰因素多。
③胆固醇与邻苯二甲醛-硫酸试剂产生稳定的紫红色。邻苯二甲醛-硫酸比色法不需要对胆固醇进行抽提而直接进行测定。
酶法是目前常规应用方法，其优点是快速准确、专一性强、样本用量少、不需抽提，便于自动化分析和批量测定，是中华医学会检验学会推荐的胆固醇测定的常规方法。
高铁-硫酸显色法测定血清总胆固醇是用异丙醇为溶剂提取血清胆固醇，向异丙醇胆固醇抽提液中加入高铁-硫酸显色剂，胆固醇与显色剂反应生成稳定的紫红色化合物，颜色深浅与胆固醇浓度成正比，可进行比色测定。
【器材和试剂】
1.器材 带塞试管、微量移液器、721分光光度计、快速混匀器、 离心机 、恒温水浴箱。
2.试剂
（1）异丙醇（AR）
（2）三氯化铁储存液：称取三氯化铁（FeCl 3 ﹒6H 2 O AR） 0.1g/>，溶于100ml冰醋酸中。
（3）显色剂：三氯化铁储存液与浓硫酸（AR）按1:1体积混合。
（4）5.17mmol/L胆固醇标准储存液:精确称取重结晶胆固醇（MW 386.66）200mg，用异丙醇溶解并稀释至100ml，置冰箱保存。
（5）胆固醇标准溶液：5.17mmol/L胆固醇标准储存液4ml，移入100ml容量瓶中，加异丙醇至刻度线。
【 操作步骤 】
1.取血清0.1ml，置于带塞 试管 中，向管底吹入异丙醇2.4ml，冲散血清，使蛋白质沉淀，加塞混匀后置于 60℃/>水浴1～2min。然后，于快速混匀器上混合15s。离心（3000r/min）5min，取抽提液待用。
2.取干燥 试管 3支，分别标记空白管、标准管和测试管，按下表加入试剂。
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试管号 |
空白管 |
标准管 |
测试管 |
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胆固醇标准液（ml） |
— |
1 |
— |
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抽提液（ml） |
— |
— |
1 |
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异丙醇（ml） |
1 |
— |
— |
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60℃/> 水浴 保温1min |
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显色液（ml） |
3 |
3 |
3 |
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60℃/> 水浴 保温15min |
冷却后，选用波长540nm以空白管调零进行比色。读取并记下吸光度。
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|
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正常值：3.10～5.70mmol/L
【附注】
抽提液与显色剂混合时产生热量，发热程度与显色深浅有关，故操作时应注意：
１.同一批标本测定时需要同样口径及厚度的试管。为了便于快速混合，试管口径最好大些。
２.沿管壁加入显色剂，须与异丙醇抽提液分为两层，然后迅速混合。不可边加边摇，否则显色不完全。
3. 显色剂必须加一管混合一管，不可加完后一起混合，混合手法也须一致。
【临床意义】
成人胆固醇的正常值为：1100～2300mg/L（2.82～5.95mmol/L）总胆固醇增高，常见于以下疾病：
１.甲状腺功能减退、动脉硬化、冠状动脉粥样硬化心脏病及高脂血症等。
２.糖尿病：特别是并发糖尿病昏迷时，几乎都有总胆固醇升高。
３.慢性肾炎肾病期、肾病综合症、类脂性肾病等。
４.胆总管阻塞时，总胆固醇增高且伴有黄疸，但胆固醇与总胆固醇的比值仍正常。
５.长期高脂饮食、精神紧张或女性妊娠期，总胆固醇也可升高。
６.家族性高总胆固醇血症（低密度脂蛋白受体缺乏），家族性载脂蛋白β缺乏症、混合性高脂蛋白血症。
总胆固醇降低见于以下疾病：
１.甲状腺功能亢进、营养不良、慢性消耗性疾病。
２.家族性无β或低β脂蛋白血症。
【思考题】
指出目前临床最常用的 血清 胆固醇的测定方法，并与本实验方法比较，指出它们的优缺点。
