免疫球蛋白IgG的提取分离纯化

一、材料与试剂配制

1．动物血清

2．硫酸铵饱和溶液：硫酸铵800g~850g，H 2 O1000mL

加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH 4 OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H 2 S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

3．0.01Mol/LpH7.4PB液：
A液：0.10Mol/LNaH 2 PO 4 液
NaH 2 PO 4 •2H 2 O15.60g加H 2 O至1000.mL
B液：0.10Mol/LNa 2 HPO 4 液
Na 2 HPO 4 •12H 2 O35.80g加H 2 O至1000mL

取A液19mL，B液81mL加水至1000mL即可。

4．1％BaCl 2 溶液

5．纳氏液

KI 80.00g加H 2 O至500.00mL

溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00mL，混合即可。

6．0.50Mol/L的HCl液和0.50Mol/L的NaOH液。

7．洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。

8．透析袋（或玻璃纸）。

二、操作方法

1．取20mL血清，加生理盐水20mL，再逐滴加入(NH 4 ) 2 SO 4 饱和溶液10mL，使成20％(NH 4 ) 2 SO 4 溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。

2．3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

3．在上清液中再加（NH 4 ） 2 SO 4 饱和溶液30mL，使成50％（NH 4 ） 2 SO 4 溶液，充分混合，静置30min。

4．3000r/min离心20min，弃上清。

5．于沉淀中加20mL生理盐水，使之溶解，再加（NH 4 ） 2 SO 4 饱和溶液10mL，使成33％（NH 4 ） 2 SO 4 溶液，充分混合后，静置30min。

6．3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。

7．用10mL生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

8．透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。

以1％BaCl 2 检查透析液中的SO 4 2- 或以纳氏 试剂 检查NH 4 + （取3~4mL透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH 4 + 存在），直至无SO 4 2- 或NH 4 + 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。

9．离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG（即γ球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。

10．过DEAE－纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以0.01Mol/LpH7.4PBS（0.03Mol/LNaCl）洗脱，收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。

11．蛋白质及其定量鉴定。

12．IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。

（1）区带电泳：玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。

（2）琼脂双相双扩散鉴定：预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。

（3）免疫电泳鉴定：孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。

（4）圆盘电泳鉴定：用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。

13．IgG的浓缩与保存

（1）IgG的浓缩：