聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA 片段，从而免除基因重组和分子等一系列繁琐操作。

由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。

PCR进行的基本条件是：

（1）以 DNA 为模板（在RT－PCR中模板是RNA ）；

（2）以寡核苷酸为引物；

（3）需要4种dNTP作为底物；

（4）有 Taq DNA 聚合酶。

PCR每一个循环由三个步骤组成：

（1）变性加热模板DNA ，使其解离成单链；

（2）退火降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA 所需扩增序列结合；

（3）延伸在适宜温度下，Taq DNA 聚合酶利用dNTP使引物端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA 链。

每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35个循环后，目标DNA 片段可能性扩增可达235 倍。

PCR的影响因素：

（1）模板 单、双链DNA 或RNA 都可作为PCR的模板，若起始材料是RNA ，需先通过逆转录反应得到一条cDNA 。为提高PCR反应的特异性，所加DNA 模板量应作相应的调整，如DN A（ng），染色体DNA （μg），待扩增片段（104 拷贝数量）来作起始材料。

原料可以是粗制品，但不能混有蛋白酶、核酸酶、TaqDNA 聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA 的蛋白质。

（2）引物 引物是决定PCR结果的关键。引物的设计应遵循以下原则：

①引物的长度一般为18-25个碱基

②G+C含量一般为40-60%

③碱基的随机分布

（3）反应温度和时间 PCR涉及变性、退火、延伸三个不同温度和时间。通常变性温度和时间为95℃，45秒至1分钟，过高温度或持续时间过长会降低TaqDNA 聚合酶活性和破坏dNTP分子。

退火温度可选择比变性温度（Tm ）低2-3℃，变性温度按Tm =4（G+C）%+2（A+T）%计算。在Tm 值允许的范围内，较高的退火温度有利于提高PCR特异性，退火时间一般为0.5-1分钟。延伸温度为72℃，时间与待扩增片段长度有关，一般1Kb 以内片段延伸时间为1分钟，如扩增片段较长可适当增加时间。

（4）Taq DNA 聚合酶 目前有两种Taq DNA 聚合酶供应：从噬热水生菌中提取的天然酶和大肠杆菌表达的重组TaqDNA 聚合酶（Ampli TaqTM ）。

两种酶都有5’-3’外切酶活性，但均缺乏3’-5’外切酶活性。在PCR中，它们可以相互替代，催化典型的PCR所需酶量为l～2.5单位。酶量偏少则PCR产物相应减少，酶量过高则会增加非特异性反应。

（5）dNTP浓度 dNTP在饱和浓度（200 μmol/L）下使用。由于 dNTP溶液有较强酸性，配制时可用 l mol/L NaOH溶液将其贮存液（50 mmol/L）的 pH调至 7.0～7.5。分装小管于-20℃保存。过多冻融会使其降解。

（6）PCR缓冲溶液 在反应体系中二价阳离子的存在至关重要，镁离子优于锰离子，而钙离子无效。它对引物与模板的结合、产物特异性、错配率、引物二聚体的生成及酶的活性等方面有较大影响，镁离子浓度一般在 0.5～2.5 mmol/L之间。每当首次使用靶序列和引物的一种新组合时，尤其要调整Mg+2 浓度至最佳。

本实验从小鼠肝脏中提取的DNA 中扩增β-actin基因，其片段长度为800 bp。

PCR扩增仪、掌式离心机、0.5ml PCR 管

1．PCR扩增试剂盒

2．引物1：5 ATCTGGCACCACACCTTCTACAATG 3

引物2：5 CGTCACACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC 3

3．标准DNA ：DL 2000

1.在0.5ml PCR塑料管中加入下列物质，并混匀。

10×PCR buffer(free Mg +2 )

5μl

25mmol /L MgCl2

dNTP

3μl

4μl

引物1

0.5μl

引物2

0.5μl

Taq(5U/μl)

0.25μl

模板(DNA < 0.1μg )

5μl

ddH2O

总体积

31.75μl

50μl

2.将上述PCR反应混合物混匀放入PCR仪中。

3．PCR循环： 94℃

5 min

1个循环

94℃

45 Sec