细胞色素C的制备及测定

【实验目的】

1．学习细胞色素C的理化性质及其生物学功能。

2．掌握制备细胞色素C的原理。

3．掌握制备细胞色素C的操作技术。

【实验原理】

细胞色素C是呼吸链的一个重要组成成份。是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。

细胞色素C分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH 10.8，分子量为12000～13000道尔顿。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。

细胞色素C分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C制成还原型的，氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm，这一特性可用于细胞色素C的含量测定。

由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。

【实验材料】

1. 实验器材

绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；72l型分光光度计；玻璃柱(2.5×30cm)；下口瓶； 烧杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋

2. 实验 试剂

⑴ 2M H 2 SO 4 溶液；1M NH 4 OH溶液；固体硫酸铵

⑵ 25％硫酸铵溶液: 100m1蒸馏水中含25克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度

⑶ 0.2％氯化钠溶液：称0.2克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml.

⑷ BaCl 2 试剂 ： 称12克BaCl2 , 溶于100ml蒸馏水中

⑸ 20％三氯醋酸溶液

(6) 人造沸石(60～80目)

⑺ 联二亚硫酸钠(Na 2 S 2 O 4 ·2H 2 O)

【实验操作】

1．细胞色素C的制备

⑴ 材料处理:

取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。

⑵ 提取:

称取绞碎猪心肌肉500克，放人2000m1烧杯中，加蒸馏水1000ml，在电动搅拌器搅拌下以2M H2S04调pH至4.0(此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2小时，在提取过程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。

在即将提取完毕，停止搅拌之前，以1M NH40H调pH至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液。滤渣加入750m1蒸馏水，再按上述条件提取1小时，两次提取液合并。

⑶ 中和:

用1M NH 4 OH调上述提取液至pH 7.2(此时，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来)，静置30～40分钟中后过滤，所得滤液准备通过人造沸石柱进行吸附。

⑷ 吸附与洗脱:

人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25％的硫酸铵洗脱下来，利用此特性将细胞色素C与其它杂蛋白分开。具体操作如下：

①人造沸石的预处理：称取人造沸石11g，放入500m1烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12秒钟内不下沉的过细颗粒。

② 装柱：选择一个底部带有滤膜的干净的玻璃柱(2.5×30cm)，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入蒸馏水至2/3体积，保持柱垂直，然后将己处理好的人造沸石带水装填人柱，注意一次装完，避免柱内出现气泡。

③ 上样：柱装好后，打开夹子放水(柱内沸石面上应保留一薄层水)将准备好的提取液装入下口瓶，使其通过人造沸石柱进行吸附。柱下端流出液的速度为1.0ml/分钟。随着细胞色素C的被吸附，柱内人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为黄色或微红色。

④ 洗脱：吸附完毕，将红色人造沸石从柱内取出，放入500m1烧杯中，先用自来水，后用蒸馏水搅拌洗涤至水清，再用100m1 0.2％NaCl溶液分三次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清，按第一次装柱方法将人造沸石重新装入柱内。

用25％硫酸铵溶液洗脱，流速大约2ml/分钟，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色开始消失时，即洗脱完毕。人造沸石可再生使用。