Small RNA问题大集合

Small RNA是一大类调控分子，几乎存在于所有的生物体中。Small RNA包括：miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。

Small RNA通过多种多样的作用途径，包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除，来调控生物体的生长发育和疾病发生。Small RNA转录组测序是鉴定和定量解析small RNA的新方法和有力工具。

Roche GS FLXTitanium 、IlluminaHiseq2000和AB SOLID 4均可以对SmallRNA进行大规模测序分析，Illumina Hiseq2000 和ABI Solid的读长正好配合了small RNA的短序列且通量大，可以得到更高的覆盖率，Illumina Hiseq2000在small RNA测序中广泛应用。

通过对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的Small RNA图谱，实现包括新Small RNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、Small RNA聚类和表达谱分析等科学应用。

Small RNA测序有什么样的样品要求？

答： (1) 样品纯度要求：OD值应在1.8至2.2之间；电泳检测28S:18S至少大于1.5。

(2) 样品浓度：total RNA浓度不低于200 ng/μL，提取总RNA时请不要使用过柱法提取总RNA，样品总量不低于20 μg (SmallRNA: total RNA大于0.3%)。或提供浓度大于20ng/μL，总量大于1μg的Small RNA样品。

(3) Small RNA样品请置于-20℃保存；请提供Small RNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上QC数据，包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。如需进行多次样品制备，需要提供多次样品制备所需样品

(4) 样品运输：样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。建议使用干冰运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。

Small RNA分离的方法？

答：现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA(200 nt以上)，Small RNA往往被淘汰掉，因而不适用于Small RNA的分离纯化。

有机溶剂抽提能够较好的保留Small RNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。目前还有另外一些Small RNA分离专用的试剂盒。如MirVana miRNA IsolationKit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够富集10 mer以上的RNA分子，又兼备离心柱快速离心纯化的特点。

对于Small RNA测序，我们采用PAGE胶电泳对小RNA进行分离。客户可以选择他们感兴趣的Small RNA长度进行研究。Small RNA的长度为18-30nt。我们推荐的测序长度为35bp，之后对序列信息进行修剪，去除接头序列仅留下Small RNA序列。

Small RNA测序文库的构建方法及质量控制？

答： 由于Illumina Hiseq2000的读长足够满足Small RNA测序的读长要求，且数据读取量大，性价比高，因此Illumina Hiseq2000在Small RNA测序方面得到广泛的应用。采用Illumina Hiseq2000进行Small RNA测序其文库构建方法如下：

(1) PAGE胶纯化特定大小的小RNA分子；

(2) 5′接头连接和纯化；

(3) 3′接头连接纯化；

(4) RT-PCR扩增；

(5) Small RNA文库的纯化；

(6) 文库的检测。Small RNA文库需要通过电泳检测和Agilent Technoligies 2100 分析仪检测以分析测序文库中片段的大小、纯度和浓度。

采用Illumina Hiseq2000进行Small RNA测序时Read/Tag的长度是多少？推荐的覆盖深度是多少？

答：对于Small RNA测序，客户可以选择他们感兴趣的Small RNA长度进行研究。Small RNA的长度为18-30nt。针对Illumina Hiseq2000我们推荐的测序长度为35 bp，之后对序列信息进行修剪，去除接头序列仅留下Small RNA序列。

对于Small RNA发现和分析的研究，由于需要对Small RNA进行表达分析，因此测序过程中我们不推荐覆盖深度(Depth ofCoverage)。一般每个样本至少获取500万条读数(read)，信息量足够保证准确的序列测序。

高通量测序研究sRNA 优势？

答：目前研究Small RNA的方法主要是通过实时定量PCR以及基因芯片技术，这些方法主要关注microRNA的表达和定量，并仅局限与研究那些序列信息或二级茎环结构信息已知的SmallRNA，无法寻找和发现新的Small RNA分子。

基于高通量测序技术的Small RNA测序技术突破了目前研究技术手段上的局限性，使研究人员能够直接对样本中的SmallRNA进行高通量测序，

其主要优势有：

(1) 可以直接从核苷酸水平上研究Small RNA分子，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题，非常利于区分相同家族以及序列极为相似的不同Small RNA分子；

(2) 可以对任意物种进行高通量分析，无需任何预先的序列信息以及二级结构信息；

(3) 灵敏度高，测序通量大，为Small RNA分子的发现和研究提供了极大的数据深度与覆盖率，能够检测丰度极低的稀有转录；

(4) 测序产生的原始数据可以与多种分析软件兼容，可以注释Small RNA的基因组信息，并分析其表达水平，能够随时使用公用Small RNA数据库注释已知的Small RNA，还可以进一步分析未匹配的数据，发现新的Small RNA种类及异构体，寻找更深入的研究信息。

Small RNA测序的影响因素

答：SmallRNA测序的影响因素主要有以下几个方面

(1) 客户提供样本的质量，进行Small RNA测序过程中，需要对Small RNA进行分离，分离Small RNA的质量和纯度直接影响测序结果。由于RNA容易降解，因此RNA的抽提、纯化等操作一定要严格按照实验要求进行，以保证样品的质量。

(2) 构建文库的质量：文库构建需要PAGE胶分离纯化SmallRNA，然后连接接头进行纯化后才能进行RT-PCR，在此过程中，要小心操作保证Small RNA无降解，同时纯化过程要保证接头去除干净，残余的接头会对后续的测序产生影响。

(3) 测序文库的上样量控制：这个因素也会很大程度影响簇生成的密度，由于上样量非常小，只有1-8 pg，所以能否准确定量微量样品也成为影响测序通量的重要因素。