三维全息显微镜快速鉴别细胞技术

来源：美国《光学与光子新闻》2011年6月2日（月刊）封面主题新闻

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导读：近几年三维计算全息显微镜的发展为生物成像研究开辟了新纪元。三维计算全息技术所包含的数据处理使研究者获得丰富的量化信息，这些信息包含着非介入实时条件下的细胞和微生物结构。

数字全息在很多方面类似经典全息照相，不同的地方在采用光电子感应器代替感光胶片。这样使得数字全息的数据处理可以应用于生物医学、公共医疗和环境监测等许多方面。这项技术已经结合显微镜被广泛应用到生物样品的三维可视化成像。

全息成像原理是相干光源通过半透明镜头时，光束的振幅和相位在光和物质相互作用时受到调制，这种调制信号使得输出波前带有物体全部三维结构信息。

使用数字全息显微镜（DHM），我们可以间接记录物体波前的相位和振幅信息。通过单个全息样本，数字重构生物样品不同深度层次的图像。因此，DHM一般被归类为三维光学计算显微镜。DHM的核心部件是光学干涉仪，用来形成来自细胞和微生物的菲涅尔衍射光和参考光的干涉场。光学干涉场的强度分布用光电成像感应器（如CCD或者CMOS相机）进行数字化成数字全息图，其中的编码包含着生物样品的三维结构信息。反向的菲涅尔变换将对全息图进行解码并重构样品特有的相位和振幅调制信息。这样DHM不需要对样品扫描就可以拥有激光扫描共聚焦显微镜进行三维成像的优点。

传统的明视场显微镜通过样品的光学吸收构建图像而丢失相位信息。由于细胞质和大部分细胞器的的光学吸收系数很小，结果二维的明视场的细胞图像通常对比度低很难观察到有用的细节部分。一个增加半透明细胞的典型实例就是利用高吸收系数的染料对细胞进行染色和固定。可惜这种介入过程经常终止细胞的生命周期。而细胞生物学家却需要监测活细胞，研究其行为和动力学过程。幸好光学相位对细胞质和周围介质之间的折射率变化很敏感。这个特性已经被用到传统的相衬和干涉场显微成像技术拍摄高对比度的图像。可惜这两个传统技术不能提供细胞的厚度信息。虽然相衬显微镜和微分干涉（DIC）显微镜在过去在细胞定性方面提供可重用应用，但无法进行定量分析也不能进行细胞和微生物的自动鉴别。再者，为了对生物样品不同层面聚集，相衬和DIC显微镜还必须进行机械扫描。这会增加成像时间并限制细胞实时检测和时间动态过程研究。

DHM是一种定量相位成像方法，直接和非介入地提供活体细胞的光学厚度和动态条件。光学厚度跟细胞厚度和通过细胞折射率的三维形态有关。这样结合计算机算法，DHM就成为非介入三维实时成像和鉴别细胞、微生物的实用技术。一张全息图只需要单次曝光就包含样品三维结构的丰富定量信息，用来鉴别细胞和辨认物体。为了这个目的，我们可以结合已经发展起来的自动鉴别物体并被应用于医学、军事、机器人等各种工业的模式鉴别技术。

最近，一些研究人员提出使用三维感应和成像系统作为基于细胞三维结构和态的非介入自动细胞鉴别技术。生物样品的实时、自动拍摄、分析和鉴别将有助于疾病诊断、环境监测、和流行性疾病的早期检测。而传统的生物表征方法则需要介入、劳动强度高和耗费时间多，要求染色的方法也对细胞造成危害，还不能有效进行大规模应用。另外，基于二维特性如样品的形状、大小和形态的分析并非总能令人信服。所以，集合了三维计算成像、信息光学和DHM非常有希望作为可靠、自动和低价的工具应用于细胞（如血液或干细胞）的快速感应、可视化和鉴定。

目前的DHM方法有单次曝光同轴伽柏全息显微镜，得益于简单、小型和低价的系统，作为三维细胞鉴别具有很好的工作性能。结合微流器件和光镊微操作等其他技术，DHM还可以可以进行更复杂的分析和细胞操作控制。