酶切反应的建议

互联网2013-09-06

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酶切反应建议

一、建立一个标准的酶切反应

目前大多数研究者遵循一条规则，即 10 个单位的内切酶可以切割 1 μg 不同来源和纯度的 DNA 。通常，一个 50 μl 的反应体系中， 1 μl 的酶在 1X NEBuffer 终浓度及相应温度条件下反应 1 小时即可降解 1 μg 已纯化好的 DNA 。

如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过 16 小时）也可完全反应。

二、选择正确的酶

不言而喻，选择的酶在底物 DNA 上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个 GC 含量 50% 的 DNA 链，一个识别 4 个碱基的酶将平均在每 44 （ 256 ）个碱基中切割一次；而一个识别 6 个碱基的酶将平均在每 46 （ 4096 ）碱基切割一次。

内切酶的产物可以是粘端的（ 3' 或 5' 突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的 Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends 一文。

三、酶

内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的 DNA 通常需要超过 1 U/ μg 的酶才能被完全切割。参见目录第 244 和 264 之切割质粒 DNA 和包埋法切割 DNA 。

四、 DNA

待切割的 DNA 应当已去除酚、氯仿、乙醇、 EDTA 、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。 DNA 的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第 252 页至 253 页之甲基化相关内容。

五、缓冲液

对于每一种酶 NEB 都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎 100% 的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为 1X 。有的酶要求 100 μg/ml 的 BSA 以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供 100X 的 BSA （ 10 mg/ml ）。不需要 BSA 的酶如果加了 BSA 也不会受太大影响。关于缓冲液更详细的信息参见第 234 页。

六、反应体积

内切酶活力单位的定义是： 1 小时内， 50 μl 反应体积中，降解 1 μg 的底物 DNA 所需的酶为一个活力单位。因此酶： DNA 的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在 5% 以下，要注意酶的体积不要超过总体积的 10% （一般酶都贮存于 50% 的甘油中）。

七、混合

这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！

八、反应温度

大部分酶的反应温度为 37 ℃ ；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为 50-65 ℃ 不等。参看第 244 页 Activity of thermophiles at 37 ℃ 。

九、反应时间

1 酶活单位的定义时间为 1 小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第 241 页酶在反应中的存活时间。

十、终止反应

如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在 NEB 我们使用如下反应终止液： 50% 的甘油， 50 mM EDTA （ pH8.0 ），和 0.05% 溴酚蓝（ 10 μl/50 μl 反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（ 65 ℃ 或 85 ℃ ， 20 分钟）。

热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第 240 页热失活表。此外，酚 / 氯仿抽提也可以用于终止反应。

十一、贮存

大部分酶应贮存于 -20 ℃ 。少部分酶则须在 -70 ℃ 长期保存。详情请参见相关酶的 DATA SHEET 或目录相关部分。 10X BUFFER 和 100X BSA 于 -20 ℃ 保存。 BSA 不能与 NEBuffer 混合后保存，否则将会出现 BSA 沉淀。

十二、稳定性

每隔 1-2 个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在 -20 ℃ 条件下十分稳定。高于 -20 ℃ 条件下稳定性将有所降低。

十三、对照反应

如果发现您的 DNA 底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物 DNA （待切底物）与加入了内切酶的对照 DNA （有多个已知酶切位点）同时进行反应。

若实验结果表明底物 DNA 降解，则说明 DNA 在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物 DNA 保持完整，而对照 DNA 被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照 DNA 和待切底物 DNA 混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。

如果有抑制剂存在（通常是盐、 EDTA 或酚），则混合物里的对照 DNA 也无法被切开。