【资源】实验九 转化克隆的筛选和鉴定

1．目的

学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。

2．原理

利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片段的克隆菌落。

3．器材

旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。

4．试剂

LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，70%甘油（70%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris-HCl pH8.0）。

5．实验准备

无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/ml氨苄青霉素。

6．操作步骤

方法一：酶切鉴定

（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3ml LB（含50mg/ml氨苄青霉素），用记号笔写好编号。

（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3ml LB（含50mg/ml Amp）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。

（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。

（4）将提取到的3管质粒样品与空质粒同时电泳，根据分子量判断和选区有插入片段的质粒，然后可用酶切、与目的片段一同电泳来鉴定其上的外源插入片段大小是否与预期相符。

（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500ml菌液与500ml 70%甘油混合后-80℃保存。

（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

方法二：快速PCR筛选法

（1） 在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。

（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。

ddH2O 16μl
10×PCR buffer（不含MgCl2） 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 1μl（12.5~25pmoles）
10μmol/L primer2 1μl（12.5~25pmoles）
Taq酶 0.5μl（1.5U）
总体积 25μl

模板质粒： 用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗。

（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：

① 94℃ 5min

② 94℃ 1min

③ 54℃ 1min

④ 72℃ 1min50s

⑤ goto② 29 times

⑥ 72℃ 10min

（2)PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片段同时比对）。观察胶上是否有预计的主要产物带。

（3)按照编号找到培养皿中的原菌斑，根据需要进行放大培养提取其质粒。

（4)提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，用酶切以进一步确认。

7．思考

（1）PCR法筛选的优点和缺点是什么？

（2）酶切法与PCR法筛选方案哪个更可靠？

（3）最终确认克隆的方法有哪些？