胶束电动毛细管色谱法分析替考拉宁

　　【摘要】 目的 建立毛细管电泳分离替考拉宁各主要组分的新方法。方法 通过表面活性剂的浓度、缓冲液的浓度及pH、温度及电压的优化，选择最佳的分离条件。结果 最佳分离条件硼酸盐∶磷酸二氢钠缓冲液(40mmol/L硼砂，10mmol/L磷酸二氢钠，用硼酸调节pH9.35，内含0.35%十二烷基硫酸钠)；检测波长214nm，电压30kV，30℃，基线分离了替考拉宁的主要组分，并对所建立的新方法进行了方法学验证。结论 建立的毛细管电泳法实用性强，费用低，为该品种的质量控制提供了一种可选择的新方法。

　　【关键词】 胶束电动毛细管色谱； 替考拉宁； 组分

　　ABSTRACT Objective To establish a micellar electrokinetic capillary chromatography method for separation of components of teicoplanin. Methods Concentration of surfactant, pH value, concentration of buffer, voltage and temperature as well as the optimum conditions for separation were selected. Results Using buffer containing sodium dodecyl sulfate, the base�line separation of components of teicoplanin was achieved. The new method was also validated. Conclusion The newly established method may be used in quality control and stability study.

　　KEY WORDS Micellar electrokinetic capillary chromatography; Teicoplanin; Components

　　替考拉宁(teicoplanin)是继万古霉素后开发的另一种抗耐药菌糖肽类抗生素，它主要对革兰阳性需氧菌和厌氧菌具有较强的抗菌活性，特别对耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)引起的感染有很好的疗效，是目前临床治疗多重耐药菌感染的重要抗生素［1］。替考拉宁是由6个化学结构非常相似的化合物组成的混合物(图1)。文献报道的分析方法为高效液相色谱法［2，3］。毛细管电泳技术作为近十几年发展起来的新的分离技术，在医药、化工等领域得到广泛地应用。胶束电动毛细管色谱(MEKC)是电泳技术与色谱技术的交叉，既能分离带电组分又能分离中性物质，是毛细管电泳中应用最有效的方式之一，在药物分析中有着广泛的应用。本文将胶束电动毛细管色谱法应用于测定替考拉宁中的6个主要组分，为该药的质量控制和稳定性研究提供了一种新方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验仪器

　　高效毛细管电泳仪：BeckmanP/ACE5000型，紫外检测器，黄金系列色谱工作站，未涂层石英毛细管67cm(有效长度60cm)×50μm(河北永年光导纤维厂)。

　　1.2 实验材料图1 替考拉宁的结构式

　　硼砂(分析纯)，硼酸(分析纯)，十二烷基硫酸钠(SDS)(分析纯)，磷酸二氢钠(分析纯)，替考拉宁及替考拉宁A2�2组分(华北制药集团研究开发新药中心，批号070601)。

　　1.3 实验方法

　　(1)溶液的制备 取样品约50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解，并稀释制成每1ml含2.0mg的样品溶液，摇匀，备用。取替考拉宁A2�2组分50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并制成每1ml含2.0mg的溶液。

　　(2)电泳条件 毛细管为67cm×50μm未涂层石英毛细管；背景缓冲液为硼酸盐∶磷酸二氢钠缓冲液(40mmol/L硼砂，10mmol/L磷酸二氢钠，用硼酸调节pH9.35，内含0.35%SDS)；操作电压30kV，毛细管柱温30℃，压力进样2s(低压)，紫外检测波长214nm。

　　2 实验结果

　　2.1 SDS浓度对分离的影响

　　以SDS为表面活性剂形成胶束，并考察了SDS的浓度对分离的影响，实验结果表明，当浓度增加到3.3%时，分离度达到最高，继续增加浓度到4.5%时，使得与各组分的作用进一步加强，迁移时间大大增长，但分离度并没有增加，因此，确定了SDS的最佳浓度为3.3%。

　　2.2 缓冲液的种类及浓度对分离的影响

　　分别考察了不同的缓冲液系统(磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和tris�磷酸缓冲液及硼砂缓冲液)，结果表明只有硼砂缓冲液可以得到很好的分离。缓冲液浓度对分离的影响较大，硼砂缓冲液的浓度升高，使ζ电位降低，电渗流减小，迁移时间延长，分离度变大；当缓冲液浓度为40mmol/L时，分离度升高达到最高；进一步增加硼砂缓冲液的浓度，使电流增加和焦耳热增加，导致色谱峰的扩散，分离度降低。

　　2.3 缓冲液的pH对分离的影响

　　阴离子表面活性剂SDS形成的胶束的电泳迁移方向与电渗流方向相反，背景缓冲液的pH值对分离的影响较大。在本实验中，化合物的迁移时间随pH值的升高而延长，这是可能由于增大了化合物在胶束相中的分配系数，使化合物的迁移时间变长。实验证明当pH9.35时最佳，各主要组分的达到基线分离。

　　2.4 磷酸二氢钠对分离的影响

　　当缓冲液中加入少量磷酸二氢钠时，分离度明显增加。当磷酸二氢钠的浓度增加到10mmol/L时，分离度升高达到最高，进一步增加时分离度不再增加。

　　2.5 温度及电压对分离的影响

　　温度的变化对分离效果的影响较小。本实验选择的温度为30℃，其分离度能满足实验要求；虽然电压对分离度的影响较小，但能改变分离的速度，电压升高，迁移速度变快，分离所用时间变短，实验中采用30kV电压。

　　2.6 有机溶剂对分离的影响

　　在缓冲液体系中，使用有机添加剂可改变被分离物与胶束的相互作用和替考拉宁各组分在胶束相中的分配系数。向运行缓冲液中加入乙腈可加快分离速度，但对分离的效果影响并不显著，因此本实验未加入有机溶剂。

　　2.7 检测限

　　以替考拉宁中含量最高的A2�2组分为实验样品，信噪比S/N=3为指标，测得本方法的最低检测限为0.2%。

　　2.8 精密度试验

　　取替考拉宁供试品溶液，重复进样6次，测定方法的精密度，结果见图2，6个主要成分A3�1、A2�1、A2�2、A2�3、A2�4和A2�5迁移时间的相对误差(RSD%)分别为0.08%、0.09%、0.30%、0.42%、0.60%和0.64%；6个主要成分峰面积的相对误差RSD分别为3.0%、

　　图2 替考拉宁主要组分的胶束电动毛细管

　　分离色谱图1.7%、0.64%、1.3%、0.68%和0.80%。

　　3 讨论

　　本文建立了胶束电动毛细管色谱法测定替考拉宁6种主要组分的方法。所建立的方法简便、快速，峰形良好，分离度高，无需有机溶媒，费用低，没有环境污染，为分析替考拉宁提供了一种新方法。

　　在胶束电动毛细管色谱中，同时存在疏水作用和静电作用，实验发现替考拉宁各组分的色谱行为与液相色谱行为一致，说明在胶束电动毛细管色谱中疏水作用占主导地位，即替考拉宁各组分通过疏水作用实现分离。

　　本实验中发现在缓冲液中加入少量磷酸二氢钠可以提高分离度，其机制有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　［1］ 夏振强，古勇，官家发. 糖肽类抗生素替考拉宁研究进展［J］. 天然产物研究与开发，2005，17(2)：247～252.

　　［2］ 付靖，刘崧. 高效液相色谱法检测替考拉宁组分及其有关物质［J］. 河北化工，2006，29(8)：62～63.

　　［3］ 杨红，秦川萍. HPLC法测定替考拉宁组分和有关物质［J］. 中国抗生素杂志，2006，31(3)：184～192.