慢病毒载体基础知识及应用
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慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂(图1)。
慢病毒载体具有宿主范围广,免疫原性低,基因容量大,可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。
慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达,因而可构建稳转细胞株,用于基因的细胞功能研究。使用慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗,CRISPR/Cas9文库构建使用的也是慢病毒载体。
2.慢病毒包装与纯化
慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装,收集细胞培养上清,通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。
3.慢病毒滴度检测
检测方法:定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数
实验原理:慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组
4.慢病毒载体优势
① 表达时间长:慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上,实现基因长时间稳定的表达,不随细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的首选,常用于构建稳转株
② 安全性高:未发现致病性,慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗
③ 免疫原性低:直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验
5.慢病毒载体应用
5.1 体外感染细胞
慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,因而可以达到持久性表达,从而构建稳定细胞株,用于基因的细胞功能研究。
体外使用慢病毒感染细胞需要注意,由于每种细胞对慢病毒的敏感性不同,有的容易感染,有的比较难,同时每种慢病毒载体荧光强度也有差异,所以正式实验前需要做病毒感染预实验来确认MOI值以达到理想的实验效果。
MOI值是multiplicity of infection 的缩写,即感染复数,其含义是感染时病毒与细胞的数量比值,一般以实验中某个细胞,感染达到80%,定义为这个细胞的MOI值,即病毒量与细胞数的比值;加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000
注意:理论上MOI值越高,慢病毒感染上的可能性越大,感染效率越高,但是这样对细胞的毒性也越大,因此,预实验确认MOI值要在细胞成活率和感染效率中找到一个平衡点。一般如果MOI超过100,甚至200还感染不是,说明慢病毒非常难感染这株细胞,甚至感染不上,考虑换一种方式,如腺病毒或电转。
5.2 体内构建成瘤模型
体内应用时,慢病毒可以携带目的基因或萤光素酶基因,筛选稳定表达的肿瘤细胞株,直接接种构建皮下成瘤模型,或通过原位或静脉注射等方式构建转移模型,活体成像检测用于研究体内肿瘤的发生发展或转移等。