慢病毒载体基础知识及应用

1.慢病毒载体概述

慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂（图1）。

慢病毒载体具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。

慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达，因而可构建稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。使用慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗，CRISPR/Cas9文库构建使用的也是慢病毒载体。

2.慢病毒包装与纯化

慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装，收集细胞培养上清，通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。

3.慢病毒滴度检测

检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数
实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组

4.慢病毒载体优势

① 表达时间长：慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上，实现基因长时间稳定的表达，不随细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选，常用于构建稳转株
② 安全性高：未发现致病性，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗
③ 免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验

5.慢病毒载体应用

5.1 体外感染细胞

慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳定细胞株，用于基因的细胞功能研究。
体外使用慢病毒感染细胞需要注意，由于每种细胞对慢病毒的敏感性不同，有的容易感染，有的比较难，同时每种慢病毒载体荧光强度也有差异，所以正式实验前需要做病毒感染预实验来确认MOI值以达到理想的实验效果。
MOI值是multiplicity of infection 的缩写，即感染复数，其含义是感染时病毒与细胞的数量比值，一般以实验中某个细胞，感染达到80%，定义为这个细胞的MOI值，即病毒量与细胞数的比值；加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000
注意：理论上MOI值越高，慢病毒感染上的可能性越大，感染效率越高，但是这样对细胞的毒性也越大，因此，预实验确认MOI值要在细胞成活率和感染效率中找到一个平衡点。一般如果MOI超过100，甚至200还感染不是，说明慢病毒非常难感染这株细胞，甚至感染不上，考虑换一种方式，如腺病毒或电转。

5.2 体内构建成瘤模型

体内应用时，慢病毒可以携带目的基因或萤光素酶基因，筛选稳定表达的肿瘤细胞株，直接接种构建皮下成瘤模型，或通过原位或静脉注射等方式构建转移模型，活体成像检测用于研究体内肿瘤的发生发展或转移等。

此外，也可以体内定位注射慢病毒，或瘤内注射慢病毒等。