讲真，RCR 实验的这些坑你都躺过吗？

我们检测的是 GALV（gibbon ape leukemia virus）病毒的可复制性，根据现有 paper 中的做法，一是通过 qPCR 检测 GALV 病毒某段特定序列，二是 PG4 细胞空斑实验。

根据论文中的引物序列我们合成了引物，然后通过 SYBR 法来检测目的基因。一个很简单的 qPCR，看似一切都很正常，然而后续问题却接连不断！

首先是待测样品显示阳性，即便是 DEPC-H2O，重复 3 次也显示阳性；其次，即使在待测样品（细胞上清，含有病毒）中加入 DNase 和 RNase 使其充分酶解消化，结果仍为阳性；最后，从阳参来看，引物特异性不是很好。

qPCR 后电泳结果显示阳性。

样品 1 为阳参，2 为待测样品，7 为 DEPC-H2O

方法 A：DNase I + RNase inhibitor，37℃ 30 min + 70℃ 10 min

方法 B：DNase I + RNase A，37℃ 1 h + 70℃ 10 min

方法 C：RNase A，37℃ 1 h + 70℃ 10 min

一下子冒出这么多问题，让我有点手足无措了。仔细排查原因后，我觉得问题应该出在生物安全柜上，因为每次都是先在生物安全柜操作待测样品，然后是阳参，很有可能是操作过程中的气溶胶出现了交叉污染！

随后我在另外一台生物安全柜上操作待测样品，重新设计了引物，再次 qPCR 时，奇迹出现了，待测样品真的是完完全全的阴性！

按照 paper 中给出的 protocol：第一天六孔板铺板 10 万细胞，第二天使用 GALV 病毒感染 2 h 后换液，然后每天换液继续培养，直到待测组 (未使用病毒感染，只有 PG4 细胞组) 全部长满，此时阳性组 (GALV 病毒感染 2 h 组) 会出现很多空斑，即细胞不能长满。

现在问题来了，一直听同事说 PG4 细胞有点奇怪，它不像 PG13 细胞，293T 细胞和 Hela 细胞等在培养皿里是均匀平铺的，而是许多细胞聚集在一起成为一个个细胞群，这样细胞群和细胞群之间本来就有很大的空洞，那怎么来证明这些空洞是因为 GALV 病毒导致的呢？

后来同事甚至怀疑这个细胞了，干脆又买了一支细胞，然而新买的细胞和原来的 PG4 细胞形态差别太大，以至于他更加迷糊了。

同事无奈将这个实验转交给我来做。我首先从这两株细胞中断定原来的应该是 PG4 细胞，因为后来的细胞是从某宝买来的。

然而我也遇到了同样的问题：细胞并不是均匀平铺的，而是一片一片的。即使我换了培养皿，培养瓶等，即使我传代是用枪吹的很匀，即使我找有多年养细胞经验的大神来铺细胞。

我停下实验，仔细思索，决定单独拿出两皿细胞不再传代一直培养，因为先前我就是怀疑培养时间--3 天--有点短，所以我每天给这两盘细胞换液观察，等到第 6 天，奇迹出现了，细胞真的长满了！！！

接着马上开始实验，同样在第 6 天待测组和阴性组完全长满，阳性组则是一个个空斑！

最后该染色了，paper 中使用的是 Gemisa 染色，我试了两次效果都很一般，主要是不能将细胞形态完美的呈现出来，还好我有多年染色经验，果断换成 HE 染色，结果如下图，棒棒哒！

以上就是我的 RCR 实验经历，这次实验让我更加自信，遇到问题时首先要全面排查问题，不要只关注某个点，其次是一定不能瞎想，要多看 paper，多和牛人交流，最后就是一定要坚持下去！