天下武功,唯快不破:如何快速筛选色谱柱?
「天下武功,唯快不破」,这是星爷电影《功夫》中火云邪神告诉我们的一个道理。
而对于常年奔波实验一线、兼屌丝与油腻气息于一身的科研汪,快速选择色谱柱开发出检测方法不仅可以使我们「治秃有望」,亦可成为撩取小师妹芳心的工具。
所谓知己知彼,快速选择色谱柱建立在对它深入了解的基础上,我们今天就来聊聊那个「它」。
色谱柱的结构
色谱柱由接头、螺帽、柱管、填料、垫圈及过滤片等组成,其中填料为色谱柱的核心部分,科研工作者在填料上发挥奇思妙想,开发出市面上种类繁多的色谱柱,每种色谱柱又有其独特的选择性及应用。
色谱结构
常用的色谱柱填料基质为硅胶,硅胶作为基质有如下优点:
无毒无味,化学性质稳定。
具有高机械强度和高的比表面积。
可利用表面健合反应来广泛满足正相、反相、离子交换和体积排阻色谱的需求。
硅胶填料通式
根据 R3 基团的不同,可将色谱柱分为不同的类型。
键合是指将固定相共价结合在载体颗粒上,键合相色谱可分为正相色谱和反相色谱。
键合方式分为单官能键合、二官能键合及三官能键合:
A:三官能团键合,键合相稳定、pH 耐受范围高
B:二官能团键合:增加载样量及方法稳定性
C:单官能团键合:柱效高,平衡块,但稳定性相对较差
由于键合烷基的空间阻位,键合最多只能反应 50% 左右的硅羟基,超过一半的活泼硅羟基能与碱性基团会发生离子交换作用,增加了保留,导致峰形拖尾。
另外,在酸性条件下,氢离子通过未封端的 Si-OH 的间隙进攻-O-Si 键,可导致填料水解。
用短链硅烷(如三甲基氯硅烷)键合活性的硅羟基,可以减小这种影响,这种技术被称为封尾。
硅胶键合相技术改进
1、空间位阻
普通的色谱柱在 pH <2 时不稳定,发生水解,导致键合相流失。当我们用异丙基、二异丁基来取代甲基的话,就在键合相上形成一个保护层,这样不仅能抗水解能力(pH1 - 8),还能防止分离化合物与硅羟基之间的作用,改善峰型。
2、极性嵌入
在碳链上键合了极性基团,流动相在该基团处形成了水「屏蔽」层媒介,水层间接屏蔽了带负电的硅羟基与目标分离物接触可能性,减少与酸、强碱性化合物的吸附,减少了拖尾现象的产生,大大地改善了色谱峰型对称性。
极性嵌入的另外一个优势是碳链键合极性了基团,表现出对极性物质有更强的选择。
另外,极性嵌入可降低「脱水」(疏水塌陷)危险,即使在含水量高的流动相条件下,样品也同样有稳定保留和最佳峰形。
疏水塌陷:普通的 HPLC 色谱柱在有机溶剂含量低甚至 100% 水流动相条件下,一旦流速停止,推动水溶液流动相进入硅胶孔隙的压力减小,当压力降低时,疏水的微孔表面排斥极性流动相,便会发生键合相孔隙脱水,从而导致所谓的「疏水塌陷」,对化合物的保留能力大大减弱。
留时间与填料表面积与配体有关,如果硅胶表面未湿润,那么有效的色谱保留减少 95%,记住:几乎所有的表面积都在孔内。
3、双层表面修饰
在硅胶新增加表面层硅羟基活性更低的新硅羟基 pH5.2(普通硅羟基 pH 约为 3.5),低表面硅羟基活性,抑制二次保留 。
4、双齿键合
键合相的两个硅原子之间以 Si-O-或-CH2-CH2-等基团相连,每个硅原子含有一个长链硅烷基官能团。有效地防止了超纯硅胶载体在高 pH 时的溶解,使其在高 pH 流动相中保持了极佳的稳定性,耐受 pH 达 11.5,特别适用于分离游离的强碱性化合物。
5、杂化技术
普通硅胶在 pH>8 的条件下很容易被水解,且仅需要 4 根 Si-OH 键被水解断裂后即有 1 个单元的氢氧化硅释放,导致柱效下降;而杂化硅胶需要水解 6 根 Si-OH 才可将含有亚乙基桥的硅胶单元溶出,且断裂的 Si-O-Si 有可能重新连接。
所以杂化颗粒技术硅胶有较宽的 pH 及温度耐受性。如 Waters Xbridge C18 柱 pH 耐受范围 1 - 12,低 pH 条件下温度上限 80 ℃,高 pH 条件下温度上限 60 ℃。
6、核壳技术
核壳型(core-shell)色谱填料是由著名色谱科学家 Jack Kirkland 在 2006 年研制成功的一种新型色谱填料,是指在实心硅胶球表面高密度均匀的键合了多孔硅胶层,这种壳状颗粒具有极窄的粒径分布,在提供了足够的保留和选择时,可以同时减小轴向和纵向扩散,允许使用更短的色谱柱和较高的流速以达到快速、高分辨率分离。
此外,通过优化孔隙大小和多孔层厚度,使得目标分离物实现良好的穿透,从而最大程度地提高分离能力。
核壳型色谱柱所产生的反压明显低于 UHPLC 色谱柱,低反压可以使仪器承受压力降低,使得在常规的液相仪上就能够实现超高效液相仪的分离效果。
核壳型色谱柱对仪器的柱外死体积要求高、且柱容量小于全多孔色谱填料,因而并不适用于大规模的制备液相分离需求。
HPLC 作为一种分析技术在药物分析、生命科学、化学等领域有着极为广泛的应用。填料做为色谱技术的核心,一直是色谱研究中最丰富、最有活力、最富于创造性的研究方向之一。近年来,色谱填料技术呈现一大趋势,利用亚 3µm 小粒径硅胶、核壳型硅胶及 UPLC 实现复杂样品的快速高效率分离。
参考:
[1]https://zhidao.baidu.com/question/ 449992197.html
[2]http://news.ifeng.com/society/ 2 /detail_2013_05 / 04 / 24919456_0.shtml
[3]https://mp.weixin.qq.com/s/dYuDjalRHsUndqx50 -_fRg
[4]http://mooc.chaoxing.com/nodedetailcontroller/visitnodedetail?knowledgeId = 2586280
[5]http://www.258.com/product/ 14036796.html
[6]https://wenku.baidu.com/view/ 4e88584fc850ad02de80412b.html?from = search
[7]https://wenku.baidu.com/view/ 8a95918ffab069dc51220175.html?from = search
[8]http://www.dxy.cn/bbs/topic/ 33734464
[9]https://www.instrument.com.cn/news/ 20140609 / 133014.shtml
[10]Phenomenex Aeris 中文手册