绿脓杆菌的培养与测定

绿脓杆菌（铜绿假单胞菌）是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、水体和医院等环境中，是一种常见的致病菌。绿脓杆菌的培养通常使用液体培养基或固体培养基，通过提供适当的营养物质和条件，促进绿脓杆菌的生长和繁殖。测定绿脓杆菌的方法包括生化试验、分子生物学方法、荧光染色法等。

绿脓杆菌的培养和测定常用于基础科学研究、医学诊断、食品卫生检测等领域。

绿脓杆菌菌株、液体培养基、固体培养基、试管、培养皿、生化试剂、荧光染色剂等。

1、培养基的制备：将适量的营养肉汤培养基（BHI）或大肠杆菌 LB 培养基加入适量的蒸馏水中，混合均匀，然后加热至完全溶解，再进行高压灭菌。

营养肉汤培养基配方：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂 20.0 g（液体培养基不含），蒸馏水 1.0 L，pH 7.0。

2、培养基的接种：在灭菌的培养基中加入所需的抗生素（如果需要），然后用无菌技术将绿脓杆菌接种到培养基中。

3、培养条件的设置：将接种好的培养基置于 37 ℃ 恒温培养箱中，培养 18~24 小时。

4、菌落的观察：观察培养皿中的菌落形态，绿脓杆菌的菌落通常呈现出灰色、绿色或黄绿色，呈不规则形状，边缘模糊，表面光滑或粗糙。

5、细菌涂片的制备：用无菌的铁丝环取一定数量的菌落，涂抹于玻璃片上，然后用火烧杀菌。

6、细菌涂片的染色：采用革兰染色法对细菌涂片进行染色。

① 初染：在菌膜上滴加结晶紫，以盖满菌膜为度，约 1 分钟后，用细水流将染液冲洗。

② 酶染：滴加卢戈氏碘液数滴，约 1 分钟后轻轻冲洗。

③ 脱色：滴加 95% 酒精 3～4 滴，轻轻晃动玻片数秒钟，倾斜玻片弃去酒精，如此反复数次后，流下的酒精几乎无色或稍呈淡紫色，最后冲洗。

④ 复染：滴加稀释复红染液数滴，约 1 分钟后冲洗。

⑤ 染色完毕后，用吸水纸将玻片吸干、干燥处理，滴加香柏油，镜检。

7、细菌的鉴定：根据观察到的菌落形态、细菌涂片的形态以及生化测试的结果等综合判断，确定绿脓杆菌的种类。

8、附录：

1）绿脓杆菌的菌落形态通常具有以下特征：

形状：绿脓杆菌的菌落形状不规则，呈现出分叉、分枝或网状的形态。

颜色：绿脓杆菌的菌落颜色通常呈现出灰色、绿色或黄绿色。

大小：绿脓杆菌的菌落大小通常在 2~3 毫米左右。

边缘：绿脓杆菌的菌落边缘通常模糊不清，呈现出分叉、分枝或网状的形态。

表面：绿脓杆菌的菌落表面通常光滑或粗糙，有时也会呈现出凹凸不平的形态。

2）氧化/还原测试：绿脓杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性。通过观察氧化还原指示剂的变化，可以确定绿脓杆菌的氧化还原性。

3）酸碱度测试：绿脓杆菌通常是产生酸的，可以通过酸碱指示剂的变化来检测绿脓杆菌的酸碱度。

4）碳水化合物测试：绿脓杆菌通常可以利用葡萄糖和乳糖等碳水化合物进行代谢。可以使用含有这些碳水化合物的培养基来测试绿脓杆菌。

1）绿脓杆菌菌株的选择应根据实验需求和绿脓杆菌的特性进行选择。

2）培养过程中应注意无菌操作，避免杂菌和细菌的污染。

3）培养条件的设置应根据绿脓杆菌菌株的生长特性进行设置，以促进其生长和繁殖。

4）生化试验和分子生物学方法应根据实验设计选择合适的方法和试剂，避免误差。

5）荧光染色法应注意荧光染色剂的浓度和染色时间，避免影响结果的准确性。

6）常见问题包括菌落污染、菌株不纯、生长速率过慢或过快等。

7）操作者注意防护措施，避免自身感染。