瘤细胞皮下移植侵袭模型构建

往先天性免疫缺陷的裸鼠皮下注射一定量的肿瘤细胞形成肿瘤，从而观察肿瘤的发生发展情况以及药物干扰情况等等。

常用于研究肿瘤细胞的成瘤能力、肿瘤细胞的转移、肿瘤细胞的耐药和靶分子对肿瘤细胞的发生发展的影响等等。

1、动物选购：一般选择 6 周龄左右，体重为 18~22 g 的裸鼠，检疫通过后，饲养于隔离屏障环境。

2、肿瘤细胞准备：注意计算好细胞用量，细胞量一般为 5 × 10⁶ 个/200 μl（不同细胞系的接种量可能不同）。

3、耗材准备：PBS×1、75% 酒精×1、滤纸×3 张、手套、器械盒（主要有弯剪、镊子、1 ml 注射器和止血夹）、棉球等。

1、肿瘤细胞扩增：

（a）取肿瘤细胞复苏并扩增，用 0.25% 胰酶消化，1 000 rpm 离心。

（b）去除上清，加入 1×PBS 将细胞洗一遍，再加入 1×PBS 重悬，计数，按比例稀释细胞悬液，调整为约 5 × 10⁶ 个/200 μl 的细胞悬液。

（c）用无血清的培养基吹匀离心两遍，再用无血清的培基重悬混匀，置于 0.5 ml 的 EP 管中，冰上备用（考虑到细胞活性，应尽快注射到裸鼠皮下）。

2、成瘤过程：

（a）根据实验要求分组，每组小鼠至少 5 只以上。

（b）抓取时用大拇指和食指抓住裸鼠的整个背部和头部，无名指和小指压住小腿和尾巴。棉球蘸取酒精后擦拭注射部位（背部或腋下）。用 1 ml 注射器（选择常规 1 ml 注射器即可）吸取 200 μl 细胞悬液，注射至裸鼠表皮下。

3、成瘤后：

（a）注射瘤细胞后通常在 3 天后肉眼观察，并在每次观察时都记录裸鼠的体重。

（b）成瘤之后需要定时用标尺记录肿瘤的长轴和短轴变化，并记录统计。

（c）根据实验要求，达到时间后颈椎脱臼处死裸鼠，取出肿瘤，拍照记录。拍照时注意光线，对焦清楚。

（d）计算肿瘤体积公式为：长轴×宽轴 2/2。

（a）细胞在大量扩增时为了保证细胞的活性，可以适当增加血清和抗生素浓度。

（b）皮下注射成功的标准：皮下注射形成可以推动的明显突起（参考水痘）。

（c）皮下注射瘤细胞悬液后停留几秒再拔出针头，以防止悬液随针头渗漏。

（d）注射成瘤后的小鼠容易死亡，注意实验周期。

（e）可以先进行各 3 只分组的预实验，如果在裸鼠中实在无法成瘤，可以选择其他免疫缺陷型，如 NOG、SCID 等小鼠。

（f）裸鼠成瘤由于存在个体差异，可能无法成瘤，所以在分组时尽量多，或成瘤后再进行随机分组。

（g）提高细胞的浓度能够提高成瘤速度，但这个范围并不固定，难以把握。